基于电化学酶生物传感器的食品和药物分析的研究进展

陈彦宇，关桦楠，刘雨欣，赵子璇，彭 勃

哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨 150076

酶是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。酶固定化技术是用物理或化学手段，将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护以及基础研究等方面发挥了重要作用[1]。在设计生物传感器时，根据生物传感器的用途选择合适的固定化方法。固定化方法主要有吸附法[2]、共价键合法[3]、交联包埋法[4]和包埋法[5]。吸附法不需要对酶进行化学改性，因此简单、廉价、可逆，缺点为可能存在键合不良和酶漏，稳定性差。在共价固定化中，酶与共价键结合紧密，可以合理控制酶的用量和微环境，但这种方法通常很昂贵，且对酶进行化学修饰会导致转运体稀释酶的活性。包埋法的基本原理是，载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。包埋法不需要对酶进行化学修饰，更适合于细胞。交联法，一般适用于高温有机溶剂，不需要载体，酶与交联剂之间有紧密的结合，这种方法的主要缺点是酶结晶的要求高，并且很难控制颗粒的性质。

就像所有用来抑制特定反应的药物一样，药物也可以使用基于酶抑制的策略进行检测[6]。酶抑制可以是可逆的或不可逆的。在可逆抑制中，底物和抑制剂竞争酶，称为竞争抑制。抑制剂通常是底物的结构类似物。在非竞争性抑制中，抑制剂从另一个位点而不是底物结合位点与酶结合，导致底物结合位点发生改变。因此，底物不能结合并发生竞争性抑制。抑制剂可以与游离酶或酶底物复合物结合[7-8]。通常用杀虫剂抑制特定的酶，阻止或降低酶的活性[9]。

1 电化学酶生物传感器

在电化学分析中，伏安法是常用的电分析技术，它记录电流作为外加电位的函数[10]。伏安法分为循环伏安法[11]、阶跃脉冲伏安法[12]、交流伏安法[13]、溶出伏安法[14]。安培技术是酶生物传感器中最常用的电化学技术。Amperometric生物传感器分为3类即第一代、第二代和第三代酶生物传感器[15]。第一代酶电极是由一个酶和一个载体组成的系统。在底物转化为产物的过程中，观察到氧还原为过氧化氢。在第一代酶电极中，实现了过氧化氢(+0.68 V)的氧化[16]。第一代电极的不利之处在于，在过氧化氢被氧化的电位下，其他物种可被氧化而产生干扰效应。在第二代酶电极中，电子传递是由称为介体的氧化反应物而不是氧提供的。介质使辅酶再生，介质不应与介质中的氧发生反应，而应与还原的辅酶迅速反应，并具有稳定的氧化和还原形式。理想介质的性质是：与还原酶反应迅速，具有稳定的氧化还原形式，在操作条件下稳定，在电子传递过程中不应参与副反应，其氧化还原电位应低于样品中其他电活性物质，不应有毒，其还原形式不应与氧发生反应。用作介质的材料可以加入溶液中，也可以固定在电极上[17]。通过对两代人的研究发现，当人工介质用于复杂介质时，它们会导致样品污染。因此，尽管在复杂介质中使用人工介质具有优势，必须消除第二代生物传感器中介体引起的接触。在第三代酶电极中，酶氧化还原中心和电极表面通过有机导电盐产生直接的相互作用[18]。

2 酶生物传感器在食品药品工业中的应用

近年来，基于电化学酶的生物传感器的食品和药物分析应用越来越广泛。CHAWLA等[19]开发了一种基于固定在镍纳米粒子、羧化多壁碳纳米管和聚苯胺中的漆酶修饰电极的安培生物传感器。

这种修饰是在金电极上进行的，并在pH为5.5和0.1 M(M=mol/L，下同)的醋酸盐缓冲液中，在35 ℃下进行测量。线性响应在0.1～10 μM之间，检测限为0.05 μM，灵敏度为0.694 μA·μm-1·cm-2。将所设计的生物传感器应用于10种果汁中酚类物质的测定，并与分光光度法进行了比较。在果汁中添加已知量的愈创木酚进行回收研究，回收率为95.61%。Lac/NiNPs/cMWCNT/PANI在4个月内使用了200次，失去了15%的初始活性。漆酶可用于测定多种草药、茶叶、醇类中的酚类物质，有许多不同的应用领域。与其他最近的研究相比，此研究的检出限较低。此外，从研究中可以看出，传感器的改性和纳米材料的使用非常重要，充分利用了金属纳米颗粒与碳基纳米颗粒和聚合物相结合的优势。

以黄嘌呤氧化酶为生物组分的酶生物传感器也可用于鱼类新鲜度检测。DERVESEVIC等[20]将黄嘌呤氧化酶固定在多壁碳纳米管和氧化还原无规共聚物中。对于黄嘌呤检测，进行了pH和温度的反应性研究，在pH 7.0和45 ℃下获得了最佳响应。所设计的生物传感器的线性范围为2～28 μM、28～46 μM和46～86 μM黄嘌呤，检测限为0.12 μM。利用自行设计的黄嘌呤生物传感器，从当地市场购买的鱼肉样品中成功检测出黄嘌呤。该研究发现，碳基纳米材料与一种方便的聚合物相结合，形成了一个高效的固定化平台，具有良好的协同效应。

PORTACCIO等[26]利用硫堇导电聚合物和炭黑纳米复合物建立了一种测定番茄汁中双酚A的漆酶生物传感器。从酶负载、pH和应用电位范围等方面对所设计的生物传感器进行了优化。在0.5～50 μM范围内，检测限为0.2 μM。对番茄汁进行了实际应用研究，回收率在95%到120%之间。这样的研究证明漆酶不仅可以用于酚类化合物的测定，而且可以用于农药的测定。表1总结了酶基生物传感器在食品工业中的其他最新应用。在最近的一项研究中，WANG等[27]基于交联戊二醛固定化漆酶和石墨烯修饰玻碳电极，提出了一种检测天然甾体17β-雌二醇的新型电化学酶传感器。研究了电聚合循环、赖氨酸用量、漆酶浓度等因素对传感器的选择性、重复性和稳定性的影响。在最佳条件下，17β-雌二醇在0.4～57 pM之间检测，检出限为0.13 pM。以人尿为实验对象，验证了酶传感器检测人尿中17β-雌二醇的有效性和可行性。该研究中使用的尿样表明，生物传感器可直接用于临床。

表1 酶生物传感器在食品和药物工业中的应用进展

3 结论与展望

大多数生物传感器都利用了纳米材料在传感器设计中的优势，因为它们具有较高的导电性，有助于电子从酶的氧化还原位点转移到传感器，这对于快速响应非常重要。许多生物传感器由于其应用范围广，检测限低，有可能用于实验室的早期疾病监测和食品控制，因此，它们具有巨大的商业化潜力。酶基生物传感器的主要挑战仍然是固定化平台，因为它对生物传感器的稳定性、货架期、重复性和重复性能力至关重要。因此，新的固定化平台仍然需要有效的基于酶的生物传感器。生物传感器作为高质量食品加工和药物分析的重要工具，其需求量不断增加，这就要求在生物传感器中使用先进的技术。电化学酶生物传感器是一种可靠的、灵敏度高的食品和药品分析仪器。同时考虑环境样品和生物样品时，现场生物传感器的应用可确保在最长几分钟内获得分析结果。从数据库中可以看出，酶电化学生物传感器在智能器件、纳米传感器、智能材料生物传感器等方面的研究将越来越受到重视。