低温胁迫下两叶一心期棉花叶片的生理响应和转录组分析

王晓曼，王琼珊，王孝刚，张教海，张友昌，张兴中，别 墅，夏松波

（1.湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉 430064；2.农业农村部长江中游棉花生物学与遗传育种重点实验室，武汉 430064；3.湖北省农业科技创新中心，武汉 430064）

棉花是喜温耐旱的作物，最适的生长温度为28～30 ℃，温度过高或者过低都会对棉花的生长发育及产量品质产生不利影响［1］。在春季天气回暖的时候，会因冷空气入侵，气温骤降，对作物造成损害，特别是倒春寒会导致烂苗和死苗现象。早期和晚期的倒春寒都会影响冬小麦的产量，早期倒春寒会使冬小麦产量下降19% 以上［2］。低温胁迫会使棉花种子的发芽率、发芽势、发芽指数都显著降低，导致棉花减产［3］。

为了适应棉花产业发展的新特点，湖北省农业科学院改革传统的植棉方式，选育推广适合机采的棉花品种。以早熟、产量形成期一致、适宜直播密植品种为基础，筛选出了适合机采的棉花品系CN01。CN01 属于无限果枝类型，其株形松紧度适中，抗倒伏能力强，苗期长势旺盛，结铃能力强，吐絮畅，吐絮集中，生长期集中，适合机采。已在湖北省示范4年，机采产量达到3 955 kg∕hm2。

以棉花品系CN01 和抗寒性较强棉花品系SJB016 为材料，研究2 个棉花品系在低温胁迫下不同的生理生化响应及转录调节机制，通过2 个棉花品系之间的差异表达分析，筛选与低温胁迫响应相关的差异基因及代谢通路，对提高机采棉低温抗性具有指导意义，为优化改良机采棉品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

CN01、SJB016 由湖北省农业科学院经济作物研究所提供，均为适合机采的棉花品系。

1.2 材料处理

将棉花种子用浓硫酸脱绒。将要脱绒的棉花种子放在烧杯中，加入少量浓硫酸用玻璃棒搅拌脱绒3 min，将处理后种子放入网袋中用流水冲洗去硫酸。脱好绒的棉花种子在太阳下晾晒2～3 d，每天晒5～6 h。勤翻动，晒均匀，晒到种子摇动时有响声。

两叶一心期棉花培育：选取子粒饱满的棉花种子，用规格为10 cm×10cm 的营养袋育苗。培养基质为营养土∶蛭石=3∶1，培养条件为25 ℃、RH75%、16h∕8h（昼∕夜）。

低温胁迫对两叶一心期棉花叶片影响试验：2个温度处理，25 ℃（CK）和12 ℃（低温处理），7 个时间梯度（0、3、6、12、24、48、72 h），2 个重复，每个重复为6 株长势一致良好棉花的混样。取棉花幼苗的2片真叶为后续试验材料，做好标记取样。取样后迅速放入液氮中，然后转移到-80 ℃冰箱中保存。

1.3 试验方法

参照蔡永萍［4］的方法，用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛的含量，用蒽酮-硫酸法测定可溶性糖的含量。用南京建成公司的试剂盒测定脯氨酸的含量。用天根试剂盒对棉花叶片的总RNA 进行提取，离心在室温进行。RNA 反转录和荧光定量PCR参照文献［4］。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对棉花叶片MDA 含量的影响

低温胁迫对棉花叶片MDA 含量的影响见图1、图2。由图1 可知，与对照相比，低温处理过后的SJB016 中MDA 的含量呈现略微的上升，并在6 h差异达到最大，含量增加了24.82%。由图2 可知，与对照相比，低温处理过后的CN01 中MDA 的含量呈现先升后降的趋势，并在6 h 差异达到最大，增加量为43.91%。低温处理后CN01 和SJB016 的MDA含量均在6 h 达到最大差异，并且CN01 中MDA 含量的增加量要大于SJB016。

图1 低温胁迫对SJB016 棉叶MDA 含量的影响

图2 低温胁迫对CN01 棉叶MDA 含量的影响

2.2 低温胁迫对棉叶可溶性糖含量的影响

低温胁迫对棉叶可溶性糖含量的影响见图3、图4。由图3 可见，正常情况下SJB016 棉叶中的可溶性糖含量维持在稳定的水平，低温处理的前3 h可溶性糖含量与对照基本相同，当处理达到6 h 时可溶性糖含量出现了急剧增加的现象，与对照相比增加了65.29%。处理12 h 可溶性糖含量与对照相近，然后随着时间增加低温处理的可溶性糖含量呈增加的趋势。由图4 可见，正常情况下CN01 棉叶的可溶性糖含量维持在稳定的水平，但是低温处理后，可溶性糖含量一直高于对照，在48 h 之后增长速率加快，6 h 可溶性糖含量增加了45.35%。

图3 低温胁迫对SJB016 棉叶可溶性糖含量的影响

图4 低温胁迫对CN01 棉叶可溶性糖含量的影响

2.3 低温胁迫对棉叶脯氨酸含量的影响

低温胁迫对棉叶脯氨酸含量的影响见图5、图6。由图5 可见，3、6、12、24、48 和72 h 低温处理的SJB016 棉叶中脯氨酸含量高于对照，其增加量分别为11.93%、6.36%、0.00%（0.000 23%）、6.43%、15.17% 和11.56%。从脯氨酸的含量变化可以看出，随着低温胁迫的时间延长，植物积累了更多的脯氨酸来应对变化。由图6 可见，3、6、12、24、48 和72 h 低温处理的CN01 棉叶中脯氨酸含量高于对照，其 增 加 量 分 别 为 2.1%、14.62%、17.23%、31.82%、31.48% 和57.49%。随着低温胁迫时间延长，CN01 受到的胁迫增加。

图5 低温胁迫对SJB016 棉叶脯氨酸含量的影响

图6 低温胁迫对CN01 棉叶脯氨酸含量的影响

2.4 转录组测序结果分析

从棉花叶片MDA、可溶性糖含量和脯氨酸的变化分析，低温处理6 h 棉花叶片的生理指标变化较大，所以选取低温处理6 h 的样本开展转录组测序研究。

2.4.1 筛选差异表达基因 以padj<0.05 为标准筛选差异基因，差异基因数目和表达水平分布测定结果见图7。对照与低温处理的SJB016 差异基因总个数为6 815，其中上调的基因个数为3 990，下调的基因个数为2 825；对照与低温处理的CN01 差异基因总个数为4 900，其中上调基因个数为3 547，下调基因个数为1 353；2 个棉花品系共有的差异基因总个数为3 288。受到低温胁迫后，CN01 和SJB016共同差异表达的基因达到1∕2 以上，说明这些基因对低温胁迫的响应在不同品系是保守的，特异性表达的基因决定了植物的耐冷性。

图7 差异基因个数

2.4.2 差异转录因子分析 棉花对低温胁迫的响应受多种基因协同调控，其中转录因子发挥了极其重要的作用。通过分析对照组与处理组的差异转录因子表达情况（图8）发现，在CN01 中差异表达的转录因子为124 个，SJB016 中差异表达的转录因子为235 个，这些转录因子主要隶属于25 个转录因子家族，差异基因集中分布在AP2-EREBP、bHIH、MYB、WRKY 等家族。在SJB016 中有更多的转录因子响应低温胁迫，其中WPKY 家族在SJB016 中差异表达的基因为28 个，在CN01 中只有1 个。

2.4.3 差异基因功能注释

1）GO 分析。对CN01 对照和处理的差异基因GO 注释结果见图9。差异基因注释到3 241 个基因功能，富集功能为169 个，集中在生物学过程这一大类的为116 个功能，集中在分子功能这一大类的为48 个，集中在细胞组分这一大类的为5 个。分析挑选了富集最为显著的30 个GO term 做了差异基因GO 富集柱状图。其中20 个属于生物学过程，其中单一生物代谢过程（Single-organism metabolic pro⁃cess，GO：0044710）富集到的差异基因最多，共有891 个差异基因表达。有10 个属于分子功能，其中分子内氧化还原酶活性（Intramolecular oxidoreduc⁃tase activity，GO：0016860）富集到的差异基因最多，共有22 个差异基因表达。

图8 CN01 和SJB016 中差异表达转录因子家族基因比较

图9 CN01 差异表达基因GO 功能分类统计

对SJB016 对照和处理的差异基因GO 注释结果见图10。差异基因注释到3 434 个基因功能，富集功能为193 个，集中在生物学过程大类的为148个功能，集中在分子功能大类的为45 个。分析挑选了富集最为显著的30 个GO term 做差异基因GO富集柱状图。其中21 个属于生物学过程，其中生物学过程（Biological process，GO：0008150）富集到的差异基因最多，共有3 854 个差异基因表达。有9 个属于分子功能。

图10 SJB016 差异表达基因GO 功能分类统计

2）KEGG 分析。对CN01 对照和处理的差异基因KEGG 注释结果见图11。CCL 和LCL 差异基因共注释到了122 个代谢通路。项目分析选取了富集最显著的Pathway 做富集散点图，富集通路为碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、昼夜节律—植物、磷酸戊糖途径等。其中富集到代谢途径的差异基因数最多。

图11 CN01 差异表达基因KEGG 分类统计

对SJB016 对照和处理的差异基因KEGG 注释结果见图12。CSL 和LSL 差异基因的共注释到了121 个代谢通路。选取富集最显著的Pathway 做富集散点图，富集通路为磷酸戊糖途径、不饱和脂肪酸的生物合成、糖酵解∕糖异生、脂肪酸代谢等。其中富集到次生代谢物的生物合成的差异基因数最多。

图12 SJB016 差异表达基因KEGG 分类统计

以CorrectedP-value<0.05 为指标，分析CN01和SJB016 中富集的代谢通路，发现碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解∕糖异生、抗坏血酸和新陈代谢是2 个棉花品系共有的代谢通路，是2 个棉花品系响应低温胁迫时保守的代谢途径。与光合作用和植物激素相关的基因在CN01 和SJB016 中的表达有较大的差异。

3）与光合作用相关的差异基因分析。RNAseq 测序结果显示差异基因主要分布在PSⅠ、PSⅡ、细胞色素b6∕f 复合物、光合电子传递和F 型ATPase。在CN01 中含有的差异基因个数分别为3、18、3、7、4，差异基因均表现为上调。在SJB016 中含有的差异基因个数分别为10、15、4、6、4。对比差异基因在CN01 和SJB016 中的分布，结果表明，共同的差异基因为PSⅡ上调（D2、cp43、PsbS、PsbZ）、PS Ⅰ上 调（PsaA）、细 胞 色 素b6∕f 复 合 物 上 调（PetC）、光合电子传递上调（FNR）、F 型ATPase 上调（β、b）。PsbP 和PsbQ 在CN01 中表达上升，在SJB016 中表达下降，呈现相反的表达，作为放氧复合物的组成成分，其表达变化呈现相反的趋势，其对植物光合作用的影响应该在后续加以验证。

4）与植物激素相关的差异基因分析。RNA-seq测序结果主要分析了生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）、乙烯（EY）、油菜素内酯、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）8 种植物激素相关基因的差异表达情况。在CN01 中生长素相关的差异基因共有50 个，其中上调基因为47 个，下调基因为3 个。细胞分裂素相关的差异基因为2 个，均表现为上调。赤霉素相关的差异基因数为5 个，3个上调，2 个下调。脱落酸相关的差异基因为20个，19 个基因表现为上调。乙烯相关的差异基因为10 个，8 个基因表现为上调。油菜素内酯共有4 个差异基因，1 个下调。茉莉酸相关的差异基因为5个，1 个下调。水杨酸相关基因并无明显差异。差异主要集中在生长素和脱落酸相关基因。SJB016生长素相关的差异基因共有61 个，其中上调基因为51 个，下调基因为10 个。细胞分裂素相关的差异基因为8 个，上调基因为5 个，下调基因为3 个。赤霉素相关的差异基因为6 个，5 个上调，1 个下调。脱落酸相关的差异基因为26 个，19 个基因表现为上调，7 个基因表现为下调。乙烯相关的差异基因为21 个，17 个表现为上调。油菜素内酯共有4 个差异基因。茉莉酸相关的差异基因为5 个，1 个下调。水杨酸相关基因并无明显差异。

2.5 差异基因qRT-PCR 验证结果

为验证转录组测序结果的准确性，随机选取了13 个差异表达的基因。这些基因功能分别为UDP-葡萄糖4-差向异构酶、GEPI48 原叶绿素依赖的易位子组分、赤霉素2-β-双加氧酶、黄烷酮3-双加氧酶蛋氨酸γ-裂解酶、阿魏酰CoA 邻羟基化酶、酒精脱氢酶类、NAD（P）H-醌氧化还原酶亚基J、PSII CP43 反应中心蛋白、硫氧还原蛋白、NAD 依赖的苹果酸酶59 kDa 同种型、细胞色素P450。将qPTPCR 检测到的差异基因表达结果与转录组测序结果进行比较，发现二者结果呈现的基因差异表达相似（图13、图14），在CN01 和源23 两个品系中的表达相关系数（R2）分别为0.874 4 和0.718 6，其Pvalue 值分别为0.692 9 和0.395 8，呈显著相关。

图13 CN01 实时荧光qRT-PCR 与转录组测序表达的比较

图14 SJB016实时荧光qRT-PCR 与转录组测序表达的比较

3 小结与讨论

3.1 低温胁迫对棉花叶片膜脂过氧化的影响

在面对逆境损害时，植物体内有一系列的防御机制，其中SOD、POD、CAT、AsAPOD 等酶促防御系统中的重要组分在植物抗逆中发挥了不可替代的作用，但是MDA 含量的增加会对这些抗氧化酶活性产生影响［5］。将MDA 直接加到菠菜的无细胞提取物中可以减弱SOD、POD、CAT 的活性［6］。对比了CN01 和SJB016 棉花叶片在受到低温胁迫时MDA含量的变化，发现与对照相比，MDA 含量呈先增加后减少的趋势。低温处理6 h CN01 和SJB016 的MDA 含量差异达到了最大，显著性检验结果为极显著。MDA 含量急剧上升，说明12 ℃的低温对棉花叶片造成了损害，但随着处理时间的增加，MDA 的含量逐渐下降，并逐渐与对照持平，说明当植物突然遭受到低温胁迫时其体内的膜脂过氧化程度加深，但由于并不是极端低温，随着时间增加，植物体内的防御系统以及活性氧清除系统开始发挥作用，刺激植物体内一些抗寒基因的表达，从而增强了植物的抗寒性，植物体内的MDA 含量也开始降低，并与对照趋同。该研究结果与郑国华等［5］研究低温胁迫下枇杷叶片中MDA 含量的变化趋势相同，7 ℃处理24 h 的枇杷叶中MDA 含量呈现先升高后降低的趋势，但是-7 ℃处理24 h 的枇杷叶MDA 含量呈现增加的趋势。

3.2 低温胁迫对棉花叶片渗透调节物质含量的影响

低温逆境下，植物体内常积累大量的可溶性糖，常见的有蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻多糖等。朱政等［7］研究低温对茶树叶片产生的影响，发现低温胁迫时间越长，可溶性糖积累越多，在处理10 d 后可溶性糖呈现了翻倍的增长。矮牵牛H 株系低温处理2 h，可溶性糖含量出现明显的上升，此后其含量上升较少，但是一直高于对照［8］。

与对照相比，低温处理的CN01 中可溶性糖含量一直呈现上升趋势，在48 h 后上升速率增加，并且一直高于对照，这与低温胁迫的茶树叶和矮牵牛中可溶性糖的变化趋势相同［7］。低温处理的SJB016 可溶性糖含量在6 h 急剧上升，随后下降，在24 h 与CN01 趋势相同，出现了上升速率加快的趋势。在试验过程中，遭受低温胁迫的棉花品系中可溶性糖含量高于对照，说明可溶性糖的积累对棉花抵抗低温胁迫有着重要的作用。王孝宣等［9］对耐寒性不同的番茄幼苗受低温胁迫时可溶性糖含量的变化进行了研究，发现低温处理番茄品种的耐寒性与可溶性糖含量呈显著正相关。

脯氨酸具有较高的溶解度，且无毒性，能够降低细胞的冰点，防止细胞发生脱水死亡，是重要的抗寒调节物质［10］。在低温逆境胁迫下，植物通过提高脯氨酸的含量来抵御外界环境的伤害。低温胁迫时，不同的植物体内脯氨酸的变化并不完全相同，Yele⁃nosky［11］研究发现橘属树种面对低温胁迫，脯氨酸含量变化不明显。李育军等［12］对大豆研究发现，脯氨酸的积累与抗冷性呈负相关。武辉［13］研究发现，受到低温胁迫后，高耐寒棉花品种比冷敏感棉花品种积累了更多的脯氨酸。

低温处理后CN01 和SJB016 中脯氨酸含量均高于对照，CN01 的的脯氨酸增加量要高于SJB016，该结果显示发芽试验得出的SJB016 的耐寒性高于CN01 与武辉等人研究的低温胁迫后耐寒品种有更多的脯氨酸积累结果相违背，猜测原因可能：一是低温胁迫对棉花发芽率的影响和对两叶一心期棉花的影响并不是完全同步的；二是棉花耐寒性的鉴定需要多个指标综合考虑，一个指标与前人研究不符不能完全代表该品种耐寒性差。

3.3 低温胁迫对棉花叶片光反应系统的影响

低温对植物光合作用的影响巨大，几乎可以影响参与光合作用所有主要组分正常功能的行使，包括电子传递，卡尔文循环以及气孔的开放程度等［14］。相比较PSⅠ系统来说，PSⅡ发生光抑制的现象更为常见。低温胁迫会导致PSⅡ反应中心失活，从而影响光能的吸收，造成PSⅡ的光抑制［15］。植物为了应对逆境造成PSⅡ系统损伤对植物光合作用产生影响，损伤和修复同时进行，其中起关键作用的就是D1 蛋白的快速周转［16］，损伤和修复的相对速率直接决定了PSⅡ的光抑制程度。

低温胁迫下CN01 和SJB016 光合相关基因表达发生了变化，在CN01 中PSⅡ复合物的外在蛋白PsbQ 表达上调，而在SJB016 中该基因的表达下调。有研究报道，PsbQ 的存在对PSⅡ放氧中心的结构和功能有重要的影响［17］，PsbQ 参与的PSⅡ复合物是蓝细菌PSⅡ的最佳功能形式。安飞飞等［18］发现低温胁迫使木薯叶片中PAⅡ系统中的放氧复合体的表达水平下降。Chen 等［19］发现高温胁迫3 h，小麦中PSⅡ发生了快速强烈反应，PsbQ 显著降低。从上述研究可见逆境胁迫会导致PsbQ 表达下降。

3.4 植物生长调节剂与低温胁迫的关系

植物生长调节剂在植物体内的含量很少，但对调节植物的生长发育有着重要的作用，对植物的抗寒性也有重要的作用。

岳丹等［20］发现赤霉素含量降低、脱落酸的含量升高，可以提高杏树的抗寒性，随着抗寒性的增强，ABA∕GA3的比值也上升，这与Rikin 等［21］的研究相似。植物的抗寒性与ABA∕GA3的值呈现正相关，主要是由于ABA 含量升高使得比值升高。试验测序结果显示，与ABA 相关的差异基因表达大部分表现为上调，说明为了应对低温胁迫，CN01 和SJB016都增加了ABA 的基因表达。

Yuan 等［22］发现低温胁迫会使得草果幼苗中生长素含量降低，生长素酰胺合成酶的编码基因GH3的表达量明显升高，GH3的表达会减少游离的生长素。Du 等［23］发现低温处理水稻，游离生长素（IAA）含量增加，与生长素合成的相关基因表达上调，GH3蛋白的编码基因发生下调。本研究测序结果显示，大量的与生长素相关的差异基因在低温处理的CN01 和SJB016 中表达，大部分基因表现为上调，也有部分基因表现为下调。具体的基因表达与生长素以及棉花抗冷性的影响需要后续试验验证。

Shi 等［24］发现，拟南芥遭受低温胁迫，体内生长素含量会明显降低，乙烯过量生成的突变体拟南芥表现出低温敏感，而施加了乙烯抑制剂的拟南芥表现出低温抵抗力增强。

3.5 转录因子对低温胁迫的响应

在遭受低温胁迫时，植物体内的转录因子会发生响应改变，提高植物在低温胁迫下的生存率。本研究发现，低温处理过后CN01 和SJB016 的差异表达转录因子主要集中在AP2-EREBP、bHLH、MYB以及WRKY 等转录因子家族，且差异表达基因均处于下调状态。

Chen 等［25］发现低温胁迫使得花生中AhERF4的表达量明显升高。辣椒中的转录因子CaPF1 在东部白松中过表达可以提高东部白松的耐冷性［26］。本研究中AP2-EREBP 家族转录因子下调，可能是通过负反馈调节机制来提高棉花对低温胁迫的耐性。

植物的MYB 转录因子与植物体内多种生物过程息息相关，MYB 转录因子表达的变化能够调控多种生物学过程，帮助植物正常生长发育。刘晓月等［27］发现，耐低温水稻中MYB基因在多个时间点上调，在低温敏感的植物中，MYB基因表达模式较多，说明植物可以通过调节MYB基因的表达模式来提高自身对低温逆境的适应性。本研究发现，低温处理CN01 和SJB016，MYB 家族转录因子表达有明显的差异，SJB016 下调的差异基因要多于CN01。说明MYB基因下调能够提高CN01 和SJB016 对低温的耐受性。

WRKY 是植物中较大的转录因子家族，参与的生物学过程多种多样。受到低温胁迫的杨树，有1∕2 以上的WRKY 家族转录因子表达会发生变化［28］。AtWRKY34能够负调控CBF 介导的低温应答途径［29］。本研究发现，低温胁迫处理后，WRKY基因在CN01 和SJB016 中均出现显著下调的现象，但在SJB016 中差异表达了更多的基因，这应该与不同棉花品系对低温胁迫的耐受性不同有关。