微生物源活菌除草剂活性筛选方法研究

张志刚，王开梅，吴兆圆，万中义，方 伟

（湖北省生物农药工程研究中心∕湖北省农业科技创新中心生物农药分中心，武汉 430064）

除草剂活性评价的方法多种多样，主要差异在于培养基质和培养条件，但基础材料只有种子、离体叶片或实生苗。在除草剂活性评价中，根据活性特点选择不同的评价方式和培养条件［1，2］。基于水琼脂培养基的微孔板高通量筛选方法适用于化合物的筛选，在除草剂筛选中应用最多，但可持续观察时间短，抗杂菌污染能力差，不适用于杂草致病菌的筛选。微生物源活菌剂的成分复杂，活性化合物和杂草致病菌的发现同样重要，筛选方式往往直接决定活性表现。为尽可能地让不同作用机理的成分充分表现出活性、降低假阴性率，仅使用某一种评价方法是不完整的［3，4］。本试验比较了几种除草剂筛选方法的活性反应和可操作性［5］，同时进行了不同类型样品模拟筛选，旨在找到高效、稳定的微生物源活菌除草剂筛选模式。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 种子及实生苗 狗牙根种子发芽率大于70%，保藏温度4 ℃。反枝苋种子发芽率大于95%，保藏温度4 ℃；室内栽培60～80 d 的狗牙根及反枝苋苗；采用直径4 cm 的微型盆栽培12～14 d 的狗牙根及反枝苋实生苗。

1.1.2 琼脂粉、培养基原料 琼脂粉（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产，型号为DH010-4），培养土（蛭石与东北黑土混合而成，蛭石∶黑土=3∶1），直径5、15 cm 的花盆，0.5 mm 的喷笔。

1.1.3 试剂及标准样品 乙醇、吐温-80 试剂均为市售分析纯化学试剂，除草剂标准化合物样品乙氧氟草醚、硝磺草酮为市售原药，单端孢霉素由湖北省生物农药工程研究中心化合物分析室提供。

1.1.4 供筛选试验样品 真菌和放线菌发酵液、提取物由湖北省生物农药工程研究中心微生物工程研究室提供；化学合成化合物由湖北省生物农药工程研究中心化合物分析室提供。

1.1.5 主要仪器、设备 B100-1F 型蠕动泵；KQ-250DE 型数控超声波清洗器；High Tech Lab DV8-200，1000 移液器；人工气候室（光、温、湿可调）；经过灭菌处理的96 孔组织培养板；日光灯管组（0.4 m距离光照度3 500～4 000 lx）；生物安全柜。

1.2 试验方法

1.2.1 筛选用样品的处理 狗牙根、反枝苋种子经除菌处理后以无菌水反复振荡、浸洗5 次以上，移除积水，种子摊开置于无菌操作台中吹干，备用［6］。

1.2.2 基于琼脂培养基的微孔板筛选法［7，8］先把0.7% 热琼脂分装到96 孔板中，冷却备用。将高压灭菌后的水琼脂加入96 孔组织培养板（深孔），冷却后备用。狗牙根、反枝苋种子分别转接到琼脂表面，接入种子量为20～30 粒∕孔。最后加入待测样品，加入药液量为0.02 mL∕孔，置于无菌操作台中，静置4 h后移入人工气候箱中培养。培养条件为温度25 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照度8 000 lx［9］。

1.2.3 离体叶片法筛选［10］先把0.4% 热琼脂分装到直径10 cm 培养皿中，每个培养皿加入10 mL，冷却备用。选择60～80 d 的狗牙根及反枝苋苗的健康叶片，切取叶片。每个培养皿中加入狗牙根（切取中部叶片，长度2 cm）、反枝苋叶片（完整叶片），各3对叶片正面向下紧贴在水琼脂表面，备用。每块叶片上选择2 处加上0.01 mL 待测样品，然后移入人工气候室中培养［11，12］。培养条件为温度25 ℃，相对湿度90%～100%，每天光照9 h，光照度4 000 lx。

1.2.4 微型盆栽喷雾法筛选［13，14］选用直径5 cm花盆，提前2 周播种狗牙根、反枝苋。根据种子发芽率确定每盆播种量，保证每盆出苗数在10 株左右，备用。通过低温强光控制苗高，防止植株生长过快，每个样品喷雾量为4 mL［15］。培养条件为温度25 ℃，相对湿度90%～100%，每天光照9 h，光照度4 000 lx。

1.2.5 3 种筛选方法的活性反应试验

1）活性评价指标［16，17］。不同筛选方法活性表现也不一样，使用3 种方法统计除草活性，活性以分级法进行统计。一是以株高为指标进行标记，按0、3、5、7、9 分级，0 表示无活性，指标为株高与阴性对照组株高一致，9 表示活性为100%，指标为种子未萌发，在0 与9 之间设置3 个级别；二是以植株叶片黄化数为指标进行标记，按0、3、5、7、9 分级，0 表示无活性，指标为叶片黄化数为0，9 表示活性为100%，指标为叶片黄化数为100%，在0 与9 之间设置3个级别；三是以叶片受损面积为指标进行标记，按0、3、5、7、9 分级，0 表示无活性，指标为叶片无任何损伤，9 表示活性为100%，指标为叶片受损面积≥样品液涂布面积，在0 与9 之间设置3 个级别。所有药效试验结果记录时间为120 h，持续观察时间最长为21 d。

2）标准样品活性反应试验。3 个标准样品母液浓度为1.00 mg∕mL，以无菌水稀释为12 个浓度，每个浓度设2 个重复，试验重复3 次。

3）不同来源样品对筛选结果的影响试验［18］。选择不同来源样品550 个，其中包括10 个化学合成化合物、真菌和放线菌发酵液各90 个、180 个真菌和放线菌发酵液相应的上清液及乙酸乙酯提取物。化合物样品使用浓度为1.00 mg∕mL，发酵液及上清液直接使用，乙酸乙酯提取物干燥后再用无菌水还原到原发酵液体积后使用。所有样品同时使用3 种方法进行筛选，以含0.1% 吐温-80 无菌水为空白对照，每种筛选方法中每个浓度设2 个重复。

2 结果与分析

2.1 3 种筛选方法中标准样品的活性反应结果

2.1.1 3 种筛选方法中标准样品对狗牙根的活性本试验选择的3 个标准化合物分别代表微生物除草剂中3 类常见的活性化合物。单端孢霉素的活性特征为无选择性细胞毒［19］，乙氧氟草醚的活性特征为选择性芽前或芽后除草剂，在有光的情况下发挥其除草活性。硝磺草酮的活性特征为抑制羟基苯基丙酮酸酯双氧化酶（HPPD）引起叶片黄化进而枯死。3种不同方法中同一个样品对同一靶标的除草活性应该一致，反映在浓度-活性曲线变化趋势上也应该相近。如图1a 所示，3 条曲线变化趋势相近，说明3种方法中单端孢霉素对狗牙根的活性反应一致；图1b、图1c 中微孔板法和喷雾法对应的2 条曲线变化趋势相近，说明这两种方法中乙氧氟草醚、硝磺草酮的活性反应一致，而离体叶片法相应的曲线与它们差异较大，说明离体叶片法中乙氧氟草醚、硝磺草酮的活性反应与另外2 种方法不一致，且活性反应极弱。

图1 3 种筛选方法中标准样品对狗牙根的活性变化曲线

2.1.2 3 种筛选方法中标准样品对反枝苋的活性如图2 中所示，分别代表离体叶片法（乙氧氟草醚、硝磺草酮）的2 条曲线与其他7 条曲线差异明显，说明离体叶片法中乙氧氟草醚、硝磺草酮的活性反应与其他条件下活性反应不一致，且活性反应极弱，该结果与标准样品对狗牙根的活性试验结果一致。

图2 3 种筛选方法中标准样品对反枝苋的活性变化曲线

2.2 不同来源样品的筛选试验结果

2.2.1 3 种筛选方法的有效观察时间 由于水分挥发和植物生长对水分的吸收，基于琼脂培养基的微孔板筛选法培养8 d 后，培养板中水分损失50%，作为培养基质的水琼脂出现明显缩水，部分幼苗开始脱水。离体叶片法筛选中，从第3 天开始补充无菌水，每3 d 补水1 次。狗牙根离体叶片在7 d 后，空白对照组中狗牙根叶片从切口开始出现持续扩散的黄化，空白对照组中反枝苋叶片持续观察21 d 后仍然正常。微型盆栽喷雾法筛选中，从第3 天开始浇水，每3 d 浇水1 次，持续观察生长21 d，空白对照组中狗牙根和反枝苋幼苗生长均正常。

2.2.2 3 种筛选方法中杂菌污染情况 微孔板筛选法中，以目测法对琼脂表面真菌生长情况及植物生长情况进行观测。结果（表1）显示，微孔板筛选法中不同类型样品引起狗牙根污染率差异显著，且发酵液及上清液样品引起严重的杂菌污染，而化合物及微生物源提取物样品引起的污染率与空白对照相近；发酵液及上清液样品引起的反枝苋杂菌污染率略高于空白对照，而化合物及微生物源提取物样品不引起杂菌污染。

2.2.3 样品流动性分析 本试验中所选择的550 个不同来源的样品中，真菌和放线菌都采用液体培养基（含固量3.5%）发酵。90 个真菌静置培养发酵液中63 个样品中菌丝结团，取样困难；90 个放线菌摇瓶发酵液中46 个样品中菌丝结团，取样困难。其余化合物、上清液和提取物样品母液流动性好，不影响定量取样及喷雾。

表1 微孔板筛选法中培养板内污染率

3 小结与讨论

与微孔板法和盆栽喷雾法比较，离体叶片法对不同类型化合物的活性反应存在很大的差异性。这些差异与离体叶片细胞的正常代谢、生长几乎停滞有直接关系。本试验中未使用针对狗牙根和反枝苋的病原菌标准菌株样品，所有离体叶片法在病原菌测试中的优势没有体现，但在生防菌除草剂的实际筛选中，离体叶片法的应用很广。由于离体叶片法是在一个封闭的微环境中进行，可以持续保持适宜的环境湿度，有利于植物病原菌的萌发、侵入或寄生，因此离体叶片法对植物病原菌的活性反应较另外2 种方法稳定。使用琼脂作为培养载体的微孔板筛选法更容易实现筛选的高通量，但可持续观察时间相对较短，在水分流失和真菌污染的影响得到控制后，筛选结果稳定。盆栽法处在一个开放的环境中，环境条件的变化不利于植物病原菌的侵入或寄生，植株也在持续生长，样品在植物体中的相对浓度会随着植株的生长而下降。微生物源活菌除草剂筛选与化学除草剂筛选相比较，活性成分更多样化（代谢产物或活菌），活性成分对杂草产生活性效果的时间跨度更长，培养条件对活性效果影响更大。在3种筛选法中的活性反应差异性，反映了活性成分的除草机理差异性，分别基于种子、离体叶片和植株的不同筛选方法的联合使用是稳定、高效的活菌除草剂筛选模式。