朱顶红根腐病病原菌的鉴定

孟庆忠，李孝鉴，易先达，李国荣，张 涛，吕 博

（1.湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉 430064；2.元谋县果然好农业科技有限公司，云南 楚雄 651300）

朱顶红（Hippeastrum rutilum），又称华胄兰（华北经济植物志要）、对对红、百枝莲等，是石蒜科朱顶红属多年生草本植物，原产于南美洲。朱顶红剑叶挺拔，花色丰富，花朵直径5～30 cm、花葶高度10～70 cm，花瓣形态多样，适宜盆栽、鲜切花生产、罐装裸球（无需土壤及浇水）、道路绿化、庭院装饰等，适应种植环境广、观赏花叶俱佳，作为高档观赏花卉市场前景广阔［1-4］。

目前，国内科研单位报道多以组培快繁技术为主，针对病虫害的研究较少。朱顶红的花叶病毒病和红斑病在栽培中较多常见，但对于朱顶红根腐病认识不足，很多购买进口种球的消费者在种植过程中经常发生种球根盘腐烂，近而整株枯死，多是由于土壤通透性差、水肥管理不当而引起的朱顶红根腐病。进口朱顶红种球僵球问题也困扰着消费者，一种原因可能是种球因过度低温冷藏导致自身调节问题，有待试验验证；另一种原因可能是新根萌发后受到根腐病病菌侵染，导致根尖发红腐烂，进而产生僵球现象。鲁宪［5］研究指出，朱顶红根腐病从根部侵染，引起根部腐烂，慢慢扩展至种球，引起种球腐烂。染病叶片呈现出不规则红褐色，进而引起早期黄叶。本研究结合形态学和分子生物学的方法，对朱顶红根腐病的病原菌进行鉴定，为防治朱顶红根腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离

供试材料为进口朱顶红品种花瓶（Gervase），取新萌发的发病根组织（图1）带回实验室进行病菌分离。病原菌分离采用常规组织分离法：发病根组织洗净后切成2～3 mm 的小段，置于3% 次氯酸钠溶液中浸泡45 s，然后转入75%乙醇溶液中浸泡60 s，再用无菌水清洗3 次，在无菌滤纸上吸干水分，最后用无菌手术镊将其转入马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）平板中，25 ℃培养5 d。

图1 朱顶红根腐病根部

1.2 病原菌的单孢纯化

挑取新鲜菌丝于Czapek 液体培养基中，置于25 ℃下160 r∕min 振荡培养7 d，经3 层无菌纱布过滤后，吸取少量孢子液于血球计数板中，在40 倍光学显微镜下测定孢子液浓度，并用无菌水将孢子液浓度稀释至106个孢子∕mL。再用无菌枪头吸取1 μL 孢子液于PDA 平板中，加入100 μL 无菌水涂布均匀，25 ℃培养2～3 d，挑取病原菌单菌落。

1.3 病原菌接种

菌株采用活体接种。试验设置a（划伤根部对照）、b（划伤根部接种）、c（幼嫩根部无划伤对照）、d（幼嫩根部无划伤接种）4 种处理。盆栽朱顶红品种为进口品种艾斯黛拉（Estella），盆栽土壤经过121 ℃、120 min 灭菌处理。小心挖出盆栽朱顶红新鲜根部，减少根部损伤，无菌水冲洗掉根表面土壤，用无菌双刃刀片划伤根部，脱脂棉浸透孢子液，包裹根部，对照采用无菌水浸透脱脂棉包裹，盆栽朱顶红置于25 ℃培养室，5 d 后取样观察。

1.4 病原的鉴定

1）形态学鉴定：将病原菌接种于新鲜PDA 平板上，置于25 ℃培养箱中暗培养7 d，观察菌落生长情况。挑取边缘菌丝于Czapek 液体培养基中，25 ℃条件下160 r∕min 振荡培养7 d，在显微镜下观察孢子形态特征。

2）分子鉴定：采用CTAB 法提取病原菌菌丝DNA。采用PCR 扩增核糖体RNA 内转录间隔区（ITS）基因，ITS 基因扩增使用的引物为ITS1 和ITS4，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。20 μL PCR 扩增体系：7 μL ddH2O、10 μL PCR Mix 试剂、Primer-1 和Primer-2 各1 μL、DNA 模板1 μL。PCR 产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，并将得到的基因序列与NCBI 基因库中的序列进行对比，确定菌株分类地位。

2 结果与分析

2.1 病原菌特征

病原菌在PDA 平板上的菌落呈圆形，菌丝最初为白色绒毛状，随时间菌落逐渐变为浅黄色。菌落中分生孢子有2 种形态，小型分生孢子卵圆形或椭圆形，有1～2 个横隔，大小为（19.5～20.5）μm×（5.4～6.8）μm；大型分生孢子较直或稍弯曲为镰刀形，有较多横隔，大小为（27～43）μm×（4.5～5.4）μm。

图2 病原菌菌落正面（a）；病原菌菌落背面（b）；病原菌分生孢子形态（c）

2.2 病原菌接种观察

划伤根部对照伤口轻微发红（图3a），可能是由于机械损伤导致朱顶红种球根组织酚类物质氧化物积累所致。划伤根部接种病菌（图3b）伤口处腐烂溃缩，呈红色并沿导管方向扩展，根表面可见白色菌丝。幼嫩根部未划伤接种（图3d）可见根部表皮变红，根尖侵染变红，幼嫩根部未划伤对照（图3c）未见异常病变，根尖正常。从发病根部上可重新分离得到该病原菌，重新分离得到的病原菌的培养性状，分生孢子形态及大小均与最初分离到的菌株相同，确定该菌株即为病原菌。

图3 人工接种菌株致病性测定

2.3 病原菌测序结果

将所得序列在NCBI 基因库中进行序列对比，该病原菌菌株与Fusarium solanistrain F13 菌株的相似性为100%，片段大小为537 bp，其登录号为KP310868.1。

3 小结与讨论

有关朱顶红根腐病病原菌的鉴定研究仅限于形态学方面，鉴定结果可能导致一定程度的误差。目前国际上利用形态学与分子生物学相结合鉴定病原菌已成为一种趋势［6-10］。综合病原形态特征、ITS 序列比对结果，初步确定引起朱顶红根腐病的病原菌为半知菌类丛梗孢目（Moniliales）瘤座孢科（Tuber⁃culariaceae）镰刀菌属（Fusarium）的腐皮镰刀菌（Fu⁃sarium solani）。

朱顶红根腐病是一种严重的真菌病害，侵染全株疏导组织感染，进而引发整株腐烂枯死。其病原菌存在于土壤中，主要侵染根部，刚萌动的新根根尖易感染，使根尖发红腐烂，对朱顶红的品种繁育和栽培管理危害较大。目前，国内销售的商品球大部分都是荷兰、南非等国进口，对于国内消费者来说，其价格昂贵，国内有关朱顶红育种与商品种球生产很少，严重制约朱顶红产业的发展，商品种球国产化是朱顶红产业发展的最大瓶颈，配套栽培技术方面的研究也相对滞后。吕英民等［11］指出引起朱顶红根腐病的致病菌为尖孢镰刀菌，这与本研究结果不一致，可能由于种植品种、区域土壤环境和鉴定方法不同，本研究未分离鉴定出尖孢镰刀菌。本研究初步确定了腐皮镰刀菌是引起朱顶红根腐病的病原菌之一，为朱顶红栽培管理上提供理论依据。