内外切蛋白酶连续酶解制备豆粕鲜味肽的研究

范海茹，李淑英，许斌，高雅鑫，张蒙冉，王凤忠

(中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

鲜味在我国饮食文化中占有重要地位[1]。鲜味肽是从食物中提取，或经氨基酸合成得到的小分子肽，可增强食物的鲜味和醇厚味，弱化苦味强度[2]。国内外鲜味调味品迭代升级，营养型调味品受到青睐，该类调味品含动植物蛋白水解物等，增强食品风味的同时补充人体所需的氨基酸等营养成分[3]。充分挖掘利用我国的植物蛋白资源，开展鲜味肽研究已成热点。

豆粕是大豆提油后得到的副产物，含有大豆中的全部蛋白，氨基酸组成比例较好[4]。高温豆粕经高温脱溶制得，产量占豆粕总产量的95%[5]，目前主要应用于饲料行业[6]，在食品领域的开发应用较少[7]。

酶解在食品工业中主要用来对蛋白质进行物性修饰，豆粕经酶解可制备小肽和氨基酸[8]，有效提高蛋白质的吸收利用率和营养价值[9-11]，但通常酶解产物苦味较高，限制了产品应用[12]。单一蛋白酶酶解产生的小肽含量较低，苦味大，不适宜产品开发。目前较为普遍的是连续酶解技术，可提高蛋白质的水解效率，有效缓解酶解产物单一风味的问题[13]。有研究表明，苦味形成与多肽C-末端的疏水性氨基酸和N-末端的碱性氨基酸有关，若将此类氨基酸切除，苦味值会明显降低[14]。因此，可以先用作用位点是疏水性氨基酸和碱性氨基酸的内切酶水解，再用外切酶切除这两类氨基酸，达到脱苦效果。

前期研究已确定了适合高温豆粕水解的内、外切酶和酶解工艺。本文在前期研究基础上，拟结合感官风味和理化指标，确定最适连续酶解组合工艺，探究豆粕水解肽的呈味机制，以期实现高温豆粕的高值化利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高温豆粕：市售；碱性蛋白酶(200000 U/g)、中性蛋白酶(50000 U/g)、木瓜蛋白酶(100000 U/g)：北京索莱宝科技有限公司；风味蛋白酶(≥500 U/g)：Sigma公司；甲醛、NaOH、HCl(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。

Mettler Toledo FiveEasy Plus型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；FA2004型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；FW 100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；UDK 159型全自动凯氏定氮仪 意大利VELP公司；RH-QA型恒温摇床 常州中诚仪器制造有限公司；3K15型医用离心机 Sigma公司；G136T型灭菌锅 Autoclave公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；AstreeⅡ/LS16型电子舌 法国Alpha MOS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

用粉碎机粉碎高温豆粕，过80目筛，备用。

1.2.2 连续酶解高温豆粕蛋白工艺

本批次所用高温豆粕原料的蛋白质含量为40.41%。前期研究确定的最适内切酶有碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，外切酶是风味蛋白酶；最佳酶解工艺见表1。参考刘媛等[15]的内切酶和外切酶分步酶解的方式酶解豆粕。根据内切酶种类，设计7种方案制备酶解产物，旨在改善水解液风味的同时，制备营养价值高、富含小肽的肽粉。(1)木瓜蛋白酶+风味蛋白酶(简写为Pap)；(2)中性蛋白酶+风味蛋白酶(简写为Neu)；(3)碱性蛋白酶+风味蛋白酶(简写为Alc)；(4)碱性蛋白酶+中性蛋白酶+风味蛋白酶(简写为Alc-n)；(5)碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶+风味蛋白酶(简写为Alc-p)；(6)中性蛋白酶+木瓜蛋白酶+风味蛋白酶(简写为Neu-p)；(7)碱性蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶+风味蛋白酶(简写为Alc-n-p)。

表1 蛋白酶酶解条件Table 1 The enzymatic conditions for different proteases

1.2.3 水解度(degree of hydrolysis，DH)的测定

参考叶健明等[16]的方法，采用pH-Stat法，计算水解度，其中每克蛋白质底物(豆粕)中具有的肽键毫摩尔数为8.38。

1.2.4 可溶性氮、氨基氮含量和肽氮含量的检测

可溶性氮含量：酶解上清液与底物中含氮量的比值，上清液和底物中的含氮量均用GB 5009.5-2016方法测定。

氨基氮含量：酶解上清液中游离氨基酸所含氮量与底物中总氮量的比值，游离氨基酸含氮量采用甲醛滴定法测定[17]。

肽氮含量：酶解上清液中可溶性氮含量与氨基氮含量之间的差值。

1.2.5 电子舌分析

参考王银诚等[18]的方法，略作修改。将不同酶解组合的酶解产物置于电子舌专用烧杯中，每杯样品量为100 mL。每个样品重复测定7次，选取后4次稳定后的数值计算平均值作为统计分析的原始数据。

1.2.6 滋味稀释分析(taste dilution analysis，TD)

参考Liu等和Seo等的方法[19-20]，采用比较滋味稀释分析，通过等比例稀释豆粕酶解产物进行滋味稀释因子测定。

1.2.7 氨基酸含量的测定

豆粕中总氨基酸含量的测定：称取适量样品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，充氮气1 min以排出管内空气，拧紧盖子后放入110 ℃烘箱内水解24 h，取出后冷却至室温，混匀过滤。定容到50 mL容量瓶内，定容混匀后取1 mL进行氮吹，直至吹干。用0.02 mol/L HCl复溶5 mL混匀后过0.2 μm滤膜，进液相小瓶约1 mL待用。

豆粕游离氨基酸含量的测定：样品0.1 mL用5 mL超纯水稀释并超声10 min，5000 r/min 离心15 min，取1 mL上清液加入1 mL 8%磺基水杨酸，在10000 r/min条件下离心15 min，取1 mL上清液氮吹至干，加入1 mL 0.02 mol/L HCl复溶，过0.22 μm滤膜，于4 ℃保存待测。

1.3 数据处理

每次实验至少重复3次，取平均值。实验数据以“平均值±标准偏差”表示，用GraphPad软件作图，用Design Expert 8.0.6软件进行方差分析。

2 实验结果

2.1 高温豆粕水解程度分析

本文选用前期研究确定的最适内切酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶)和外切酶(风味蛋白酶)，采用连续酶解组合的方式，设计7种方案，研究其对高温豆粕蛋白的利用率。通过对比7种酶解产物的水解度和可溶性氮含量，可初步判断产物的水解程度。水解度表示水解过程中蛋白质肽键的裂解程度；酶解产物的可溶性氮可综合反映不同酶解方案下豆粕蛋白的利用率，是氨基氮和肽氮含量之和。7种高温豆粕酶解产物的水解度和可溶性氮含量见图1。

图1 豆粕蛋白酶解产物的水解度和可溶性氮含量Fig.1 The degree of hydrolysis and soluble nitrogen content of soybean meal protease hydrolysate

由图1可知，水解度不一定会因内切酶数量的增多而提高。不同酶解产物的水解度由高到低依次是Alc-p、Alc-n-p、Neu-p、Alc-n、Neu、Pap、Alc，其中Alc-p、Alc-n-p、Neu-p、Alc-n、Neu的酶解产物水解度无显著性差异，分别为53.85%、47.55%、46.70%、41.36%和35.31%。在所有方案中，可溶性氮的含量从高到低的组合方案依次为Alc-n-p、Alc-n、Alc-p、Alc、Neu、Pap、Neu-p。水解产物的可溶性氮含量均高于80%，说明7种酶解方案均有广泛的作用位点，都能够有效地降解豆粕蛋白中疏水性物质，满足了生产需求，确保了高温豆粕蛋白可以得到充分利用。

2.2 高温豆粕酶解产物分析

7种方案的酶解组合都可以将高温豆粕蛋白较高效地酶解，在确保豆粕蛋白利用率高的同时，还要考虑所得多肽的纯度。肽氮含量和肽粉纯度息息相关，肽粉纯度与产品质量直接相关，决定产品价值，测定结果见图2。

图2 豆粕蛋白酶解产物中肽氮含量Fig.2 The peptide nitrogen content of soybean meal protease hydrolysate

所有酶解方案中，肽氮含量均在50%以上，其中Alc-p、Alc-n-p和Pap的肽氮含量高于60%，分别为66.44%、60.56%、60.31%，剩余由高到低依次是Alc-n、Alc-n-p、Neu、Alc和Neu-p酶解产物，说明内外切蛋白酶连续水解技术可以有效地将豆粕蛋白转化为多肽，有利于小肽的富集。

2.3 高温豆粕酶解产物的感官分析

本文采用电子舌技术探究了不同酶解产物的风味变化，并选择鸡精、味精、菌菇精、复合氨基酸和呈味核苷酸二钠(I+G)作为鲜味标品，探究酶解产物的呈味特性。PCA分析图见图3。

图3 豆粕蛋白酶解产物的电子舌PCA分析图Fig.3 Electronic tongue PCA analysis of soybean meal protease hydrolysate

由图3可知，2个主成分共反映原来信息的95.30%，表明PCA降维后的数据能够很好地反映原始数据信息。电子舌PCA图上样品之间的距离远近与它们之间的差异性存在一定的相关性，距离越近，差异越小[21]。不同酶解产物均落到第二和第三象限，并呈现一定的变化趋势，即“Alc→Neu→Pap”。第二象限从上到下依次为Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc，4种酶解产物的共性酶分别为碱性蛋白酶和风味蛋白酶，除此之外，Alc-n-p还有中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，Alc-n有中性蛋白酶，Alc-p有木瓜蛋白酶，Alc-n和Alc-p在位置上极为相近。第三象限从上到下依次为Neu-p、Neu和Pap，Neu-p和Neu酶解产物的共性酶分别为中性蛋白酶和风味蛋白酶，此外Neu-p较Neu多使用一种木瓜蛋白酶，Pap是木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的酶解产物。由以上结果可以看出，电子舌可以有效区分不同蛋白酶的酶解产物，对酶解风味影响较为显著的蛋白酶组合依次为：碱性蛋白酶+风味蛋白酶>中性蛋白酶和风味蛋白酶>木瓜蛋白酶和风味蛋白酶。而且可以看出复合连续酶解使用的酶种类越多，水解产物的呈味特性越丰富，这可能与产生的末端氨基酸种类多少有关。

本文选择的鲜味标品中鸡精、菌菇精和复合氨基酸落到了PCA图的第一象限，而味精和“I+G”落到第三和四象限之间且与Neu-p的酶解产物较为相近。味精是我国家常调味料，主要成分为谷氨酸钠；“I+G”由5＇-肌苷酸二钠(IMP)和5＇-鸟苷酸二钠(GMP)按1∶1的比例混合而成，是新一代的核苷酸类食品增鲜剂，是经济而且效果较好的鲜味增强剂，可直接加入食品中，起增鲜作用，是方便面调味包和其他调味品的主要呈味成分之一，与味精合用具有协同增鲜的作用，因此也被称为“强力味精”。本文研究结果表明“Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc”共处于第二象限，在风味上应该更相近且可能有一定的共性特征；而“Neu-p、Neu和Pap”共处于第三象限，Neu-p的酶解产物在呈味特性上与味精和“I+G”极为相似。

电子舌由5根味觉传感器组成，从第一象限到第四象限分别为“UMS(鲜)、SWS(甜)、STS(咸)、SRS(酸)、GPS(复合味1)、SPS(复合味2)和BRS(苦)”。参考图3中B的PCA载荷图与图3中A叠加可知，鲜味剂复合氨基酸在风味上可能偏鲜和甜一些，鸡精偏咸一些，“Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc”的酶解产物可能更酸一些，“Neu-p、Neu和Pap” 的酶解产物可能比较复合，风味上应该更丰富一些。综合电子舌分析结果，Neu-p的酶解产物在风味和呈味特性上应该更好一些，有望深入开发成鲜味肽。

2.4 高温豆粕酶解产物的滋味分析

为进一步探究影响酶解产物呈味的因素，本文对水解液的呈味特性进行了初步判断，并对产物中多肽的氨基酸组成进行了测定。TD值即滋味值，可以初步判断产物的呈味特性，值越高，呈味特性越明显。酶解产物呈味的影响因素有很多[22]，一些研究者研究发现，鲜味肽中一般会含有谷氨酸或天冬氨酸等亲水性氨基酸残基[23-24]。鲜味肽的呈鲜特性不仅与鲜味氨基酸组成有关，除此之外，还与其一级结构和氨基酸序列相关，当鲜味肽的氨基酸组成相同时，其呈味特性会因氨基酸在肽链上的位置不同而发生改变[25]。由实验结果可知，本文的7种酶解产物就滋味强弱而言共分为3组：Alc-p(TD=16)，Pap、Neu、Neu-p和Alc-n-p(TD=8)，以及Alc和Alc-n(TD=2)。就氨基酸组成分析而言，谷氨酸和天冬氨酸呈鲜味。7种酶解方案中，多肽的鲜味氨基酸所占比例由高到低是Alc-n、Neu、Pap、Alc、Neu-p、Alc-n-p和Alc-p，占比依次为38.69%、38.59%、38.54%、38.10%、37.32%、36.75%和33.55%，其中Alc-n、Neu、Pap、Alc和Neu-p的鲜味氨基酸占比相互间无显著差异，Alc-p酶解产物与其他产物有显著性差异，与Alc-n产物呈极显著差异。Alc-p的鲜味氨基酸占比最低，且滋味强度最强，致使其与鲜味标品的差异性较大，这可能与参与酶解的蛋白酶种类有关。Alc和Alc-n酶解产物中多肽的鲜味氨基酸所占比例较高，滋味强度最弱，说明外切酶有效地将肽段末端影响呈味的疏水性氨基酸切除，但是电子舌PCA分析中与鲜味标品的差异性较大，可能是因为鲜味肽在结构和氨基酸序列上的不同导致的。酶解产物就呈味特性而言大致可分为两大组：“Alc-n-p、Alc-n、Alc-p和Alc”组的酶解产物风味上可能偏酸一些，“Neu-p、Neu和Pap”组的酶解产物风味上可能比较综合，更丰富一些。特别是Neu-p，在呈味特性上更像“味精和I+G”。众所周知，味精的主要成分是谷氨酸钠，而“I+G”自身风味相对较弱，但是与味精一起，添加量只要味精的2%～5%就具有协同增鲜的作用。

综合上述结果表明，Alc-p酶解产物的TD值最大，即滋味最强，但是呈味偏酸，可能不太适合做风味肽；Neu-p酶解产物的TD值次之，即滋味较强，呈味特性与“味精和I+G”更像，极具开发鲜味肽的潜力。

图4 豆粕蛋白酶解产物中多肽的鲜味氨基酸占比和TD值Fig.4 The proportion of umami amino acids and TD values of peptides in soybean meal protease hydrolysate

3 讨论

本研究旨在改善酶解产物的风味，制备大量的营养价值高、富含小肽的肽粉，尝试连续酶解的方式，探讨内切酶和外切酶连续酶解对豆粕酶解产物的影响，综合分析7种蛋白酶组合的酶解产物的水解度、可溶性氮、肽氮和氨基氮含量说明7种酶解组合均能有效水解高温豆粕蛋白，制备纯度较高的低聚肽；通过对TD值、电子舌和氨基酸组成进行分析，发现不同酶解组合制备的水解产物风味差异较大，“中性蛋白酶+木瓜蛋白酶+风味蛋白酶”连续酶解组合，即Neu-p组，制备的酶解产物滋味较强，呈味特性与“味精和I+G”更像，极具开发鲜味肽的潜力。

通过内切酶对豆粕蛋白进行水解，酶解产物的水解度不断增大，相对分子质量逐渐降低，疏水性末端暴露，游离氨基酸和肽含量逐渐升高。耿瑞蝶等表示食品的苦味通常与蛋白质酶解所形成的能够呈现苦味的短肽相关[26]。刘伯业的研究表明，内切酶会使酶解产物的水解度提高，也增加了酶解产物中苦味肽的含量，而且在苦味感官上起到了主导作用，可能是由于蛋白酶的内切位点不同，而引起氨基酸序列不同。本研究根据酶解产物呈现苦味的问题采用连续酶解的方式，将内切酶酶解产物再次用外切酶酶解，改善了酶解产物的风味，也使高温豆粕蛋白得到了充分利用。黄金梅等研究证实采用多种酶进行分步水解，可以实现豆粕蛋白的深度水解，提高了豆粕蛋白的利用率[27]。不同蛋白酶的作用位点不同，中性蛋白酶水解Tyr、Phe等疏水性氨基酸残基的羧基端肽键，有利于风味蛋白酶发挥外切作用，改善产物的口感，这也是电子舌PCA分析中中性蛋白酶参与组合的酶解产物与鲜味标品差异性更小的原因。木瓜蛋白酶主要作用于Lys、Arg等碱性氨基酸残基的羧基端肽键，疏水性氨基酸常处在肽链中间，所以木瓜蛋白酶酶解产物与鲜味标品“味精和I+G”的差异性较中性蛋白酶酶解产物更大。碱性蛋白酶的水解位点是芳香族氨基酸残基或疏水性氨基酸残基的羧基端肽键，酶解后会使多肽C-末端的疏水性氨基酸增多，也极大增强了不良风味的强度，但是在外切酶的作用下，碱性蛋白酶的这一特点更有利于外切酶的发挥作用，又由于碱性蛋白酶有比中性蛋白酶和木瓜蛋白酶更多的内切位点，所以相对于Neu和Pap的酶解产物，多肽中的疏水性氨基酸比例会更低，致使Alc的酶解产物比Pap和Neu的TD值低。经过氨基酸含量测定后发现，在内切酶和外切酶连续酶解的过程中，酶解所得呈味肽中，谷氨酸和天冬氨酸占比较大时，可能会强化鲜味。也有研究者研究表明，除氨基酸种类外，鲜味肽的呈鲜特性还与氨基酸序列相关，氨基酸组成相同的鲜味肽，会因氨基酸在肽链上的位置不同，而发生呈味特性的变化。Tamura M等研究表明，鲜味肽结构中酸性基团和碱性基团所处位置会对鲜味产生影响，只有在C端是带负电的酸性基团，N端是带正电的碱性基团时，呈味二肽才表现出呈味特性，反之，则此肽不具备该特性[28]。但是酶解液的呈味效果不仅只单一的某种滋味，而是各种滋味的综合效果，为生产较好的鲜味调味品还应考虑不同呈味肽的相互作用。

4 结论

本研究以高温豆粕为原料，尝试先用内切酶水解，再用外切酶切除多肽疏水性末端的方式，设计了7种蛋白酶组合对其进行酶解。研究发现采用连续酶解的方式可以有效提高水解度和可溶性氮含量，达到充分利用豆粕蛋白资源的目的。7种酶解产物的可溶性氮含量均高于80%，肽氮含量均高于50%；电子舌感官分析中，Neu-p酶解产物的差异性与鲜味标品味精和I+G的差异性最小，在呈味特性上与二者极为相似；酶解产物就滋味强弱而言共分为3组：Alc-p(TD=16)，Pap、Neu、Neu-p和Alc-n-p(TD=8)，以及Alc和Alc-n(TD=2)；并发现酶解产物在感官上带来的差异，与水解度和多肽中鲜味氨基酸占比等有较大关系。综合以上结果，本研究的7种蛋白酶组合中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组合酶解产物在风味和呈味特性上应该更好一些，有望深入开发成鲜味肽。