60Co-γ辐照辣椒红油护色工艺的优化

汪菡月，陈谦，谢珂，唐艺文，黄敏，王丹，陈浩*

(1.西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621002；2.四川省原子能研究院，成都 610101；3.辐照保藏四川省重点实验室，成都 610101)

辣椒红油(chili oil)，俗称辣椒油、红油，是一种调料，一般将辣椒和各种配料混合，然后与热油混合制得[1-2]。因其味型香辣，广受我国关中地区、西南地区人们的欢迎，更是川菜中不可缺少的一味调料，如兰州的牛肉面和四川的夫妻肺片、红油兔丁都会用到辣椒油。近年来，中国休闲食品发展迅速，市场规模逐年提升[3]，预计2020年中国休闲食品市场总份额将达到1482亿元。其中辣味休闲食品已经成为所有休闲食品上市的主流口味，所以辣椒红油在休闲食品中的应用也相当广泛，目前，辣椒红油休闲食品的市场规模以每年30%的速度递增，发展潜力巨大。

目前高温杀菌法是食品企业常用的杀菌方法，但是过高的温度会改变食品的色泽、口感等，导致产品的品质变差，市场接受度降低[4-5]。辐照杀菌技术是指利用X射线、60Co或137Cs衰变所释放的γ射线、电子加速器所产生的电子束等电离辐射，与食品发生物理、化学或生物学效应，达到杀灭食品中有害微生物的目的[6-7]。与传统杀菌方法相比，辐照杀菌是一种“冷杀菌”，可以最大程度地保证食品原有的风味[8]。FAO/IAEA/WHO联合专家委员会在1980年曾经宣布“任何食物受到10 kGy以下照射量的辐照，都不会因辐照引起毒性危害”[9]。目前已有50多个国家批准可进行辐照处理的食品有200多种，已有38个国家对食品辐照进行了商业化应用。因此，将辐照处理技术应用在红油休闲食品的保藏加工中，是该行业未来发展的趋势之一，市场应用前景巨大。

前期研究发现，辣椒红油休闲食品经过辐照杀菌后会出现“褪色”现象，影响产品的市场接受度，与崔文甲等的研究结果相符[10]。这种“褪色”现象严重制约了辐照杀菌技术在辣椒红油休闲食品产业中的应用。陈菁等研究发现，加入抗氧化剂能有效提高辣椒红素的稳定性[11]。因此，本研究选择了几种对辐照辣椒红油有护色作用的天然抗氧化剂，通过响应面试验，获得辐照辣椒红油护色的最优工艺参数，避免含辣椒红油的休闲食品辐照后出现褪色现象，为推进辐照杀菌技术在辣椒红油休闲食品保藏中的应用提供了理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

干红辣椒：产地四川省广元市，购于京东超市；5 L桶装菜籽油：产地四川省德阳市，购于京东超市；番茄红素粉末(有效成分含量10%)：曲阜市圣嘉德生物科技有限公司；竹叶黄酮粉末(有效成分含量24%)、玉米黄质油剂(有效成分含量10%)：信阳市沐凡生物科技有限公司；β-胡萝卜素粉末(有效成分含量10%)：西安瑞林生物科技有限公司；虾青素油剂(有效成分含量5%)：湖北雅仕达生物技术有限公司。

丙酮(分析纯)：成都科隆化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

Eppendorf 5415R小型高速冷冻离心机 德国Eppendorf股份公司；BSA224S-CW型电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；UV-1700型分光光度计 日本岛津公司；TH-02-260型电热恒温鼓风干燥箱 成都易华天宇试验设备有限责任公司；粉碎搅拌机 广东小熊电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辣椒油的制备

二荆条干辣椒剪成段，去籽，40 ℃烘干4 h后打粉备用；菜籽油与辣椒粉质量比为5∶1，将菜籽油加热至130～145 ℃后，与辣椒粉混合，避光，晾凉至室温后，用双层纱布过滤，制得辣椒红油，备用。

1.3.2 辐照处理

辐照处理在四川省原子能研究院辐照工程中心进行，使用200万居里全自动60Co-γ辐照装置对样品进行辐照，源强约为3.33×1016Bq，辐照源剂量率为35 Gy/min，以重铬酸银剂量计测定样品的实际吸收剂量。

1.3.3 吸光度的测定

样品辐照处理后，取1 mL样品于离心管中，8000 r/min离心20 min，然后称取一定量的上清液，用丙酮(分析纯)定容于10.0 mL容量瓶中，用分光光度计在460 nm波长处，以丙酮作为参比样，于1 cm玻璃比色皿中测定其吸光度，被测样品吸光度控制在0.3～0.7[12]。

1.3.4 结果计算

式中：A为实测试样溶液的吸光度；f为稀释倍数；m为试样质量(g)；100为换算系数。

1.3.5 单因素试验设计

根据预试验结果选择番茄红素、虾青素、玉米黄质、β-胡萝卜素和竹叶黄酮5种添加剂对辐照后辣椒红油的护色效果进行单因素试验。添加剂添加量(以辣椒红油质量计)分别为：番茄红素0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/kg(以有效成分含量计，下同)；虾青素0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/kg；玉米黄质0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/kg；β-胡萝卜素0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/kg；竹叶黄酮0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/kg。

1.3.6 Plackett-Burman(PB)设计

根据单因素试验结果，发现番茄红素、虾青素、玉米黄质、β-胡萝卜素4种添加剂对辐照后辣椒红油的护色效果较明显，因此选择这4种添加剂进行PB试验。利用Design Expert 10.0.1软件设计PB试验，选用试验次数N=12的设计组合对这4个因素进行分析，另设置7个虚拟变量用于估计误差，响应值为6 kGy剂量辐照后测定辣椒油的吸光度。每个因素设置高、低两个水平(见表1)。所有试验重复3次，取平均值。

表1 PB设计各因素水平Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman design

1.3.7 最陡爬坡试验设计

响应面法优化必须在最优点的附近区域模拟真实情形，为获得最佳护色剂用量范围，采用最陡爬坡试验对影响结果显著因素进行逼近。根据PB试验结果，选择对辣椒红油有显著护色作用的护色剂及用量，根据这些因素效应大小及变化方向进行最陡爬坡试验，由此接近最大响应值的区域，所有试验重复3次，结果为6 kGy剂量下辐照后辣椒红油的吸光值，以平均值±标准误差表示。

1.3.8 响应面试验设计

根据上述试验结果，采用Box-Behnken Design组合设计，选取护色效果最明显的3种护色剂以及效果最明显的3个添加量，进行响应面试验。响应面因素水平编码表见表2。

表2 响应面因素与水平表Table 2 The factors and levels of response surface design

1.4 数据处理

采用SPSS Statistics 17.0对数据进行显著性分析，应用Microsoft Excel 2010对数据进行整理、作图，并用Design Expert 10.0.1软件对PB试验及响应面试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同添加量番茄红素对辐照后辣椒红油的护色效果

图1 不同添加量番茄红素对辐照后辣椒红油的护色效果Fig.1 Color protection effect of lycopene with different additive amount on chili oil after irradiation

由图1可知，在不同辐照剂量下，随着番茄红素浓度的升高，辐照后辣椒红油的吸光度越高。未辐照时，添加0.01，0.04，0.05 g/kg番茄红素的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；在3 kGy辐照剂量下，添加番茄红素的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；在5 kGy辐照剂量下，添加0.02，在0.03 g/kg番茄红素的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；在8 kGy辐照剂量下，添加0.03 g/kg番茄红素的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)。番茄红素是一种类胡萝卜素，在番茄中含量最多，具有着色性和抗氧化性[13]，对光极其敏感，尤其是日光和紫外光[14]。因此射线也会降低其稳定性，使其抗氧化性减弱。

2.1.2 不同添加量虾青素对辐照后辣椒红油的护色效果

图2 不同添加量虾青素对辐照后辣椒红油的护色效果Fig.2 Color protection effects of astaxanthin with different additive amount on chili oil after irradiation

由图2可知，在不同辐照剂量下，虾青素对辐照后辣椒红油有很明显的护色效果，并且随着虾青素添加量的增加，护色效果越明显。未辐照时，添加0.03，0.04，0.05 g/kg虾青素的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；在3 kGy辐照剂量下，添加0.03，0.04 g/kg的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；在5 kGy和8 kGy辐照剂量下，添加0.03，0.04，0.05 g/kg虾青素的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)。虾青素有极强的抗氧化性，对人体也有一定的保健作用，这可能是虾青素在高剂量辐照下也可以对辣椒红油有较明显护色效果的原因。

2.1.3 不同添加量β-胡萝卜素对辐照后辣椒红油的护色效果

图3 不同添加量β-胡萝卜素对辐照后辣椒红油的护色效果

由图3可知，未辐照、3 kGy和5 kGy辐照剂量下，添加β-胡萝卜素的辣椒红油与对照组相比，吸光度没有显著变高；在8 kGy辐照剂量下，添加0.6 g/kg β-胡萝卜素的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)。在β-胡萝卜素作为一种天然抗氧化剂，深受人们的喜爱，在保健品中应用很广泛。但是光照条件下，β-胡萝卜素也很不稳定，研究发现，在紫外光照射下，β-胡萝卜素分解率很高，甚至超过了番茄红素[15]，这是β-胡萝卜素对辣椒红油护色效果不明显的原因。

2.1.4 不同添加量玉米黄质对辐照后辣椒红油的护色效果

图4 不同添加量玉米黄质对辐照后辣椒红油的护色效果Fig.4 Color protection effect of f zeaxanthin with different additive amount on chili oil after irradiation

由图4可知，未辐照时，添加0.4 g/kg玉米黄质的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；在3 kGy和8 kGy辐照剂量下，添加玉米黄质的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；在5 kGy辐照剂量下，添加0.3，0.4，0.5 g/kg玉米黄质的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)。玉米黄质有延缓衰老的功效，见光易分解，所以射线也有可能会造成玉米黄质的分解。

2.1.5 不同添加量竹叶黄酮对辐照后辣椒红油的护色效果

图5 不同添加量竹叶黄酮对辐照后辣椒红油的护色效果Fig.5 Color protection effect of bamboo flavone with different additive amount on chili oil after irradiation

由图5可知，在3 kGy辐照剂量下，添加竹叶黄酮的辣椒红油吸光度显著高于对照组(P<0.05)；而未辐照、5 kGy、8 kGy辐照剂量下，不同添加量的竹叶黄酮对辣椒红油的护色效果都不显著。竹叶黄酮也具有很强的抗氧化性，但是研究发现，竹叶黄酮在光照条件下，自由基清除率明显下降，因此射线极有可能降低竹叶黄酮的抗氧化性，使其对辣椒红油没有护色效果。

2.2 Plackett-Burman(PB)试验

采用PB试验设计可以直观地看出不同的护色剂对辐照后辣椒红油的护色效果，方便进一步研究。利用Design Expert 10.0.1软件对结果进行回归分析，试验结果见表3，回归分析结果见表4。

表3 N=12的PB设计及结果Table 3 Plackett-Burman design and results of N=12

表4 PB试验结果回归分析Table 4 Regression analysis of Plackett-Burman experimental results

由表4可知，此回归模型的主效应P值为0.0032，表明PB试验设计因素在所选取的水平范围内对辐照后辣椒红油的护色作用显著，同时决定系数为0.9993，调整决定系数为0.9961，说明回归模型设计可靠。另外，由表4还可知，这4种护色剂对辣椒红油的护色作用由高到低依次为虾青素>玉米黄质>番茄红素>β-胡萝卜素，其相关性可用方程表示：

R=2.278+3.783A+12B-0.149C+0.645D+0.051E+0.04F+0.039H-0.058K-0.04433L。其中，番茄红素、虾青素、玉米黄质对辐照后辣椒红油的护色效果为正效应，而β-胡萝卜素为负效应。

2.3 最陡爬坡试验

根据PB试验的结果，4种护色剂对辐照后辣椒红油的护色效果都比较显著，根据此结果设计最陡爬坡试验，试验设计及结果见表5。

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table 5 The steepest climbing test design and results

由表5可知，随着试验序号的增加，护色剂对辐照后辣椒红油的护色效果呈上升趋势，且试验6的复合护色剂对辐照后辣椒红油的护色效果最优。考虑到GB 2760-2014中规定的食品添加剂添加量和护色剂使用成本等问题，选择第5组试验的条件作为响应面优化的中心点，并设定第4，6组试验条件为边界条件，进行下一步的响应面优化试验。

2.4 响应面优化试验

为进一步确定辐照后辣椒红油的最优护色剂组成和用量，将β-胡萝卜素的浓度固定在0.3 g/kg，以番茄红素、虾青素、玉米黄质的浓度为变量，添加护色剂在6 kGy剂量下辐照后辣椒红油的吸光度为响应值，进行Box-Behnken响应面优化，结果见表6。

表6 BBD试验设计及结果Table 6 Box-Behnken design and results

采用Design Expert 10.0.1软件对表6中试验数据进行二次多元回归拟合，获得变量(番茄红素添加量X1，虾青素添加量X2，玉米黄质添加量X3)与响应值辣椒油吸光度(Y)之间的回归模型方程：

Y=7.77+269.375X1+369.912X2-87.604X3-2907.5X1X2-4.5X1X3-403X2X3-1486.5X12-274X22+134.64X32。

表7 回归模型方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

对该回归模型进行方差分析，由表7可知，模型的P为0.0002，而失拟项不显著(P=0.0552)，说明该模型显著，拟合度良好，表明试验值与预测值之间一致性好。响应值Y的R2为0.9688，调整决定系数(RAdj2)为0.9287，说明回归模型能在92.87%的概率上解释此试验结果，有7.13%的变异不能由该模型解释。因此，该回归模型拟合程度较高，误差较小，能分析和预测护色剂对辐照后辣椒红油的护色效果。

另外，一次项X1、X2和二次项X32对辣椒红油吸光度影响表现出极显著水平，X12表现出显著水平。交互项X1X2、X2X3对辣椒红油吸光度影响表现为极显著水平。且根据显著性与F值大小可知，对辐照后辣椒红油护色效果从高到低为虾青素(X2)>番茄红素(X1)>玉米黄质(X3)。

为了反映各因素及其交互作用对辐照后辣椒红油吸光值的影响，对回归方程绘制三维响应面图，见图6。

图6 各因素交互作用对辐照后辣椒红油吸光度影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface diagrams and contour plots of the influence of the interaction of various factors on the absorbance of chili oil after irradiation

由图6可知，虾青素的护色作用最为明显，随着虾青素的增加，辣椒油颜色越深；其次是番茄红素，随着番茄红素浓度的增加，辣椒油颜色越深，但是当番茄红素浓度增加到0.05 g/kg时，辣椒油颜色不再增加；玉米黄质的护色效果随着浓度的增加呈现先减少后增加的趋势，考虑到使用成本，综合模型预测及实际成本，辣椒红油最佳的护色工艺为番茄红素0.05 g/kg，虾青素0.06 g/kg，玉米黄质0.35 g/kg，β-胡萝卜素0.3 g/kg。

2.5 最优护色工艺的确定及验证

3 结论

通过单因素试验、PB试验、最陡爬坡试验以及响应面试验，得出在番茄红素有效成分浓度0.05 g/kg，虾青素有效成分浓度0.06 g/kg，玉米黄质有效成分浓度0.35 g/kg，β-胡萝卜素有效成分浓度0.3 g/kg时，辣椒红油在6 kGy的剂量辐照后的吸光度最高。该试验结果表明，加入一定量具有抗氧化性的食品添加剂可以在一定程度上减少辐照后辣椒红油的褪色现象，有利于推进辐照杀菌技术在辣椒红油食品中的应用。