虾加工副产物蛋白肽提制及其生物活性研究进展

徐文思，张梦媛，李柏花，杨祺福,*，危纳强，杨品红，周顺祥

（1.湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南常德 415000；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000；3.环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，湖南常德 415000；4.顺祥食品有限公司，湖南益阳 413200）

虾，属甲壳类节肢动物，是重要的经济型水产品之一，其含有丰富虾青素、维生素，是一种高蛋白低脂肪食品，广受消费者喜爱。我国是虾养殖大国，2019 年全球虾的总产量约470 万吨，中国虾类总产量则达到110 万吨，约为世界总产量的四分之一[1]。而虾类在加工过程中，全虾的利用率只有约50%。目前，虾的加工副产物仅有极少部分被加工成饲料，其余绝大部分当作废弃物处理，进而造成了环境污染和资源浪费。然而，虾副产物中的甲壳素、壳多糖等物质，能降低胆固醇、抑制癌细胞生长转移，对防治心、血管疾病，降低血压、强化肝脏功能具有良好功效[2−3]。虾副产物中同样富含蛋白质，且氨基酸种类全面，包含了人体所需的8 种必需氨基酸、4 种呈味氨基酸，其中淡水虾头、壳粗蛋白中必需氨基酸占45.33%，与牛奶中必需氨基酸（46.59%）和酪蛋白中必需氨基酸（46.14%）极为接近，是优质蛋白质来源[4−5]。目前国内外主要以克氏原螯虾、麻虾、锦州对虾等淡水虾以及南美白对虾、南极磷虾、虾蛄、红虾等海虾的副产物为原料，提取制备蛋白及活性多肽，进而提高虾副产物的高效加工利用。

1 蛋白及多肽提取方法

针对于蛋白质的特性，常见的蛋白提取技术有碱提法、碱溶酸沉法、盐溶法等。

1.1 碱液提取法

碱液提取法是较为传统的蛋白提取方法。稀碱溶液可进入细胞内部，所以绝大多数蛋白质易溶于稀碱溶液，蛋白质在碱的催化作用下发生肽键断裂[6−7]。又因为蛋白质是两性化合物，在一定的碱性环境中，蛋白质以离子形式溶解于碱性溶液里，进而提取细胞中的蛋白质[8−9]。胡云虎等[9]确定了碱溶液法提取克氏原螯虾副产物蛋白的最佳条件：利用10%氢氧化钠溶液在100 ℃条件下反应4 h，此时提取出蛋白质的纯度为77.38%。陈博等[10]同样利用了碱法并加以超声波辅助来提取锦州对虾副产物中的蛋白质，在温度50 ℃、氢氧化钠质量分数10%的条件下超声波辅助提取30 min，蛋白提取率为14.16%。碱液提取法操作简单，成本低廉，但是其对环境污染较大，在提取时不仅水解程度难以控制，而且提取出的蛋白质结构也会受到不同程度的破坏[1]。

1.2 碱溶酸沉提取法

碱溶酸沉提取法，是利用蛋白质在碱性溶液中溶解，再用酸液将蛋白质提取液中的pH 调至蛋白质的等电点，使蛋白沉淀析出，最后分离清洗，调回pH，得到蛋白。南极磷虾中蛋白的溶解最适条件为pH11.5 和4 ℃，此条件下经过两次碱溶，每次30 min，蛋白质的溶出率为97.23%；酸沉的最适pH4.6，在酸沉的同时加入适量的谷氨酰胺转氨酶，能够有效提高蛋白质的得率，最终蛋白质得率为52.68%[11]。碱溶酸沉法提取虾及其副产物中蛋白质，是目前实验室内最常用的一种提取方法，工艺方法成熟，但在工业生产中会收容大量的酸和碱，有一定的危险性，对环境也会造成一定影响。

1.3 盐溶液提取法

盐溶液提取法也可称为盐析法，也是一种蛋白质提取技术。在中性的盐溶液中，蛋白质分子表面的电荷增加，能够增强蛋白质分子与水分子之间的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。通过盐溶液法优化提取虾蛄中的盐溶蛋白：在提取液pH6.36、NaCl 浓度0.11 mol/L、料液比1:3（v:w）、搅拌24 min 后，提得蛋白质含量达22.46 mg/g[12]。此法虽简单，无危害性溶剂，但是提纯率较低，且要对所提取的蛋白要进一步脱盐纯化。

目前蛋白质与多肽的界定并不明确，一般来说，肽链中含有100 个氨基酸残基时，即为蛋白质。在提取蛋白后，可以切断肽键来获得不同分子量的多肽、寡肽等。

1.4 酶解法

酶解法是一项环境友好型蛋白及多肽的绿色提取技术。在适宜的温度和pH 条件下，具有一定活性的蛋白酶存在某些特异性的催化位点，这些位点可以催化底物中蛋白质结构中的肽键发生水解，使高分子量的蛋白质断裂成低分子量的多肽。蛋白酶在水解蛋白质的同时，也水解掉与蛋白质相连的物质，能有效提高蛋白质的提取率[8,13]。

1.4.1 单酶提取 无论是海水中的红虾还是淡水克氏原螯虾，以其加工后的副产物为原料，都能在碱性蛋白酶的催化下水解，其蛋白质提取率分别为68.76%、45.76%[14−15]。Baek 等[16]研究计算发现，较中性蛋白酶而言，加入0.3%的碱性蛋白酶2.5 h 后可以得到最高的蛋白水解产物。

1.4.2 双酶提取 除单一酶水解，可以使用复合酶，效果加倍。以克氏原螯虾副产物为原料，王燕等[17]使用木瓜蛋白酶与风味蛋白酶按1:1.5 混合作为复合蛋白酶，蛋白酶用量为1.0%，料液比1:10，在pH6.5、50 ℃、3 h 条件下蛋白质提取率为54.22%；胡川[18]先以单一的碱性蛋白酶或胃蛋白酶在各自的最优条件下分别对虾副产物进行水解，蛋白提取率分别能达到61.9%和53.9%；然后通过双酶协同工艺：碱性蛋白酶酶解3 h（温度40 ℃、pH7.5、酶加量0.3%）、胃蛋白酶酶解1 h（温度40 ℃、pH3.0、酶加量0.2%），蛋白提取率倍增至86.1%，比单酶法效果更明显。复合酶的酶切位点选择性更多，有利于蛋白的水解。

酶解法提取蛋白质，过程简单，操作容易，反应条件温和，而且碱性蛋白酶处理不会对原料的壳聚糖回收率和质量产生影响[19]。但因其成本过高，目前还不利于大批量生产，而且水解过程易腐败，因此还需进一步针对规模性工业化生产进行探究[20]。

1.5 超声波辅助酶提取法

超声波辅助酶提取法是伴随以上几种方法而产生的提取方法。超声波的主要作用是利用其空化效应、热效应、化学效应、生物效应等对细胞的细胞壁和细胞膜进行物理破碎，增大物质分子的运动频率和速度，加速碱液的扩散，从而加速蛋白质的溶解速率，最终提高蛋白质的提取率[2,8]。通过超声波辅助木瓜蛋白酶提取南美白对虾副产物中的蛋白：在超声功率120 W 下处理20 min 后，并在pH7.5、木瓜蛋白酶添加量8000 U/g，60 ℃酶解3 h，最终蛋白水解度达65.25%[21]。同样，超声波也可以辅助双酶来提取南美白对虾副产物中的蛋白。pH7.5，180 W 条件下超声30 min，1%的碱性蛋白酶和0.1%的中性蛋白酶混合提取，酶解温度50 ℃，酶解3 h，蛋白水解度最高为42.5%[22]。通过超声波的机械震荡以及酶的催化作用可以提高蛋白质的提取率，同时也会增加一定的成本消耗。

1.6 微生物发酵法

微生物发酵，就是利用微生物自身的代谢作用，改变蛋白质本身的品质，产生易于消化的短肽、氨基酸等物质，使废弃物变成高附加值的发酵产品[1,20]。Bhaskar 等[23]用乳酸片球菌发酵虾副产物，在pH4.3、5%接种量、37 ℃、添加15%的葡萄糖，发酵3 d后，蛋白回收率为97.9%。国内学者用3 株乳酸菌混合的发酵剂发酵虾副产物，在加入20%葡萄糖、1:2固液比、10%接种量的条件下，维持温度39 ℃发酵5 d，蛋白回收率可达到94.0%[24]。微生物发酵法提取蛋白及多肽是蛋白回收率最高的一种提取方法，同时也存在微生物发酵条件严苛，不易控制的弊端。

总体而言，对于虾加工副产物中蛋白及多肽的提取，酶解法和微生物发酵法更有发展前景，同时也可在两种方法的基础上辅以超声波、微波等技术，提高虾副产物中的蛋白及多肽的回收率。

2 虾加工副产物多肽的生物活性

蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的，肽分子量小于蛋白质，因而容易被小肠直接吸收并进入人体发挥功效作用；虽然单个氨基酸不具有活性，但是由几个到几十个氨基酸残基以酰胺键构成的多肽具有不同功能特性，生物活性肽也称为功能性肽。活性肽可以进入细胞参与机体各种重要生理功能的调节，预防和治疗疾病[25−26]。来自虾类及其副产物中的食源活性肽具有降血压[27]、抗菌[28]以及抗氧化损伤等作用[29]。

2.1 抗氧化肽

氧化与人类及其他动物的许多疾病，如癌症、老化、风湿性关节炎、动脉硬化等的发病机理有关。人体可通过适当摄入具有抗氧化活性的物质，降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病[30]。

2.1.1 抗氧化肽分类 抗氧化肽主要由2～16 个氨基酸组成，大量存在于动物和植物体内。目前抗氧化肽主要分三类：天然存在的、通过酶解等方法获取以及人工化学合成的[15]。天然存在的抗氧化肽，是指存在于动植物体内的一些小分子活性肽，比如谷胱甘肽、肌肽、蛇肉肽等。蛋白酶酶解是当前获得抗氧化肽的主要手段之一，通过酶解使蕴含在母蛋白质中的抗氧化肽释放出来，而且酶解法条件温和、安全可控，能够较大程度保证肽的活性。人工合成的抗氧化肽有着氨基酸序列明确、高度富集的特点，而且人工合成可以弥补酶解法中多肽难以富集的缺陷[31]。

2.1.2 抗氧化肽作用机制 抗氧化肽的机理主要有两方面：一是直接途径，直接清除自由基或者抑制自由基的产生；作为供氢体或供电子体与自由基结合以清除自由基，其抗氧化活性与多肽分子的大小及氨基酸分子的组成、排列顺序有关，大多数抗氧化活性强的肽分子量小于3000 Da。二是间接途径，作用于抗氧化酶，加强抗氧化酶对自由基的清除能力或抑制氧化酶的活性；抗氧化肽提高抗氧化酶活性主要通过四个方面，第一，直接清除自由基，减少自由基对抗氧化酶的损伤；第二，加强抗氧化酶的表达，促进抗氧化酶的产生；第三，对受损的抗氧化酶进行修复，恢复其抗氧化活性；第四，抑制氧化酶的表达，减少自由基的产生[32−34]。

2.1.3 抗氧化肽制备 以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除率为筛选指标，分别以麻虾、南极磷虾、克氏原螯虾副产物为原料，测得木瓜蛋白酶酶解出的多肽抗氧化性最好，DPPH 自由基清除率的结果分别为81.6%、74.33%、94%[35−37]。利用木瓜蛋白酶酶解南美白对虾副产物，制备的抗氧化多肽的羟自由基的清除率为67.89%[38]；而克氏原螯虾副产物在碱性蛋白酶条件下制备的多肽，其抗氧化能力最强，羟自由基清除率在74.66%～85.87%[39−40]；在酶解法条件的基础上加入葡萄糖后发生美拉德反应，克氏原螯虾副产物蛋白肽在美拉德反应过后抗氧化活性明显增强，其还原力、羟自由基清除能力，DPPH 清除能力分别为未加葡萄糖反应前的8.367、1.829 倍和2.027 倍[41]。过程复杂的美拉德反应在改变食物风味和色泽的同时也会产生大量的抗氧化性物质[42]。

2.2 ACE 抑制肽

心血管疾病是世界十大死亡原因中的头号杀手。中国心血管疾病患者约2.9 亿，患病人数还在不断上升，其中高血压疾病患者占比最大，而且逐渐趋于年轻化[43]。经研究发现，食源性血管紧张素转换酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）抑制肽对抗高血压具有明显效果，而且ACE 抑制肽来源广泛、安全性高、副作用小，是治疗高血压的理想药物。

2.2.1 ACE 抑制肽来源 ACE 抑制肽主要有三大来源，一种是植物性来源，植物性来源的ACE 抑制肽来源丰富、分离纯化方便、成本低。而且，谷物和坚果的蛋白质水解液中有着更为丰富的ACE 抑制肽[44]。另一种是动物性来源，动物来源ACE 抑制肽主要以家畜、海洋生物和蛋类来源为主[45]。最后，ACE抑制肽也可由益生菌菌株发酵的乳制品产生。由于许多乳品发酵剂培养物的高度蛋白水解性质，在发酵乳制品的生产过程中可以预期形成生物活性肽[44]。

2.2.2 ACE 抑制肽作用机制 生物体内，肾素将血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ（AngⅠ），接着血管紧张素转换酶，再将AngⅠ转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），引起血管收缩，同时引起醛固酮的释放，并作用于远曲小管和集合管，使其增加对Na+和水的吸收，引起血压升高。在激肽释放酶-激肽系统中，激肽释放酶能够将激肽原转化为激肽，而ACE 则可以将激肽转化为无活性片段使血管收缩、血压升高，而ACE 抑制肽能够将形成的激肽转变成缓激肽进而降低血压[46]。

2.2.3 ACE 抑制肽制备 吴秉宇等[47]用两步酶解法提取ACE 抑制肽，用羧肽酶A、B 两步酶解南美白对虾副产物所得水解液的半抑制浓度为6.39 mg/mL，经透析和凝胶层析后得到了4 个IC50值小于0.2 mg/mL的组分，其中IC50最低为0.134 mg/mL，显示了较高的ACE 抑制活性。这也表明羧肽酶A/B 酶解可制备出高活性ACE 抑制肽。蒋长兴等[48]用胃蛋白酶水解小龙虾虾头制备ACE 抑制肽，在pH2.4，温度40.85 ℃，底物浓度10.05%，酶-底物质量比6.97，水解4.5 h 时ACE 抑制率可达到80.9%。付雪艳等[49]发现碱性酶解制备的中国毛虾多肽的降压作用及抑制ACE 生成的作用均强于中性酶解多肽，其中200 μg/g的多肽降压效果最好，相当于14 μg/g 的ACE 抑制剂卡托普利。毛虾ACE 抑制肽无论是长期预防给药还是急性治疗给药对肾性高血压大鼠均有显著的降压作用，抑制AngⅡ的生成可能是其降压机制之一。

2.3 抗菌肽

抗菌肽广泛存在于自然界生物体内，是一类小分子多肽物质，同时也是固有免疫系统的重要组成成分，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒和寄生虫等均具有较好抑制或杀伤作用。而且，抗菌肽具有无污染、无残留、广谱抗菌和不易产生耐药性的特点，且对癌细胞也具有一定的治疗功能，有望取代抗生素成为新的抗菌剂[50]。

2.3.1 抗菌肽分类 抗菌肽根据结构可分为三类，一类是α-螺旋（α-helica）型抗菌肽，其在水溶液中是无序的，但只要与生物膜接触，α-螺旋结构就会呈现两亲性。第二类是β-折叠（β-sheet）型抗菌肽，其种类最多，广泛存在于海洋无脊椎动物、植物、两栖类体内。β-折叠型抗菌肽在水溶液中排列有序，并含有保守的半胱氨酸残基，形成二硫键，增强结构稳定性，减少蛋白质降解。最后一种是延伸环状抗菌肽，组成延伸环状抗菌肽的是高比例特定的氨基酸残基。延伸环状抗菌肽不能折叠成二级结构，而且许多延伸环状抗菌肽不具备酶活性[51]。

2.3.2 抗菌肽作用机制 通过静电作用，带正电荷的抗菌肽与带负电荷的细菌表面结合，然后，再与脂质双分子层产生作用进入细胞内部。而且，当抗菌肽以垂直方式进入膜内时，肽脂比值偏高，当抗菌肽和细胞膜平衡，横跨膜孔时，肽脂比值偏低。目前活性肽作用于膜的机制主要有四种假说，第一种是桶型模型，抗菌肽分子附着在细胞膜表面，垂直插入膜内，形成膜孔，导致内外膜之间电势失衡；第二种是环形模型，与夹层磷脂分子亲水头部结合的抗菌肽分子垂直插入细胞膜内，形成较大的跨膜孔径，让抗菌肽分子进入细胞内部；第三种是地毯模型，在静电作用下，抗菌肽分子与膜平衡排列，干扰脂质双分子层，最终形成孔径，便于抗菌肽分子进入细胞内部；第四种是聚合模型，在静电作用下，抗菌肽分子与磷脂双分子层相互作用，形成大小不同形状不一的孔径，以便抗菌肽进入细胞[52−53]。

2.3.3 抗菌肽制备 中性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶酶解南极磷虾，最终制得分子量在254～709 Da 之间的混合肽，对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制生长效果，最低抑菌浓度为5 mg/mL[54]。除使用酶法外，酸液法提取南极大磷虾抗菌肽的条件为稀硫酸浓度0.28 mol/L，稀硫酸用量3.0 倍，乙醇用量2.0 倍，抗菌肽得率为1.21%[55]。关于虾加工副产物中抗菌肽提制的研究，能够为饲料用抗生素替代品的开发提供初步的参考。

2.4 其他活性

通过胰蛋白酶水解、超滤、凝胶层析、高效液相色谱等技术对海洋生物虾蛄软体组织中的活性多肽进行分离与纯化，此肽具有一定的抑制肿瘤细胞凋亡和免疫活性，对小鼠巨噬细胞的吞噬能力表现出一定的促进作用[56−57]。虾加工后的副产物经过胰蛋白酶水解得到的多肽与氯化钙反应制备的钙肽结合物，其紫外、红外光谱均表明钙与肽之间形成了新的化学键[2]。多肽也可以与Zn2+螯合后作为营养补锌剂使用，既能摄入必需氨基酸，又能促进锌元素的吸收，制得的螯合锌分子内Zn2+与多肽中的N 形成配位键，与多肽的-COOH 形成离子键，使得螯合锌以内盐的形式存在，理化性质稳定[58]。多肽与金属离子螯合有利于提高金属矿物质的生物学效价，有良好的营养补充、抗菌、抗氧化以及提高机体免疫力的效果[59]。目前在制备水产生物活性肽方面，多使用蛋白酶水解法，虽然安全环保，但酶解的程度不易控制，酶的使用成本也相对较高，可以考虑结合固定化酶技术进行活性肽的提制。

3 前景与展望

虾副产物富含蛋白质、虾青素等营养成分，对这些廉价且可利用资源进行开发利用，具有良好的经济、社会和生态效益。副产物蛋白及活性多肽的提取，多以传统的酸碱提取法为主，其需要大量的化学试剂，因此对生态环境造成影响，同时伴有一定的安全隐患。通过总结对比分析发现，酶解法和微生物发酵法具有更好的应用前景。从虾副产物中制备出的活性多肽具有抗氧化、抗菌、降血压、免疫调节、螯合金属等生物活性，可见由虾副产物提取的活性多肽在健康食品开发、人类慢性疾病治疗方面有着巨大的应用潜力。目前，以虾副产物为原料提取蛋白肽的工艺及技术还停留在实验室验证阶段，而对于规模性的产业化技术集成及应用尚需完善。此外，虾加工副产物活性肽的结构序列、活性机理还有待深入研究与揭示。