不同品种金针菇特征挥发性物质的差异分析

王鹤潼，潘泓杉，王 朝，方东路，胡秋辉，马 宁,*

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210023；2.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095）

金针菇（Flammulina filiformis）又名毛柄金钱菌，在自然界中广泛分布，适合在世界各地区生长[1]。由于其味道鲜美且营养丰富，深受国内外消费者欢迎[2]。国内生产的金针菇目前有3大类：纯白色、链体乳白色至浅黄色、金黄色至浅褐色[3]。金针菇品种繁多，并且各种新品种不断研发栽培[4]。

由于金针菇的表观形态可能会受到底物和环境因素的影响，因此通过形态鉴定区分品种较困难，缺乏系统的共识鉴定方法是金针菇育种者鉴定品种时所面临的最主要问题之一。因不同品种金针菇的生长特性、出菇特性、商品性状和生物转化率不同，而风味物质也存在各自的差别和独特之处。近年来，对于不同品种金针菇的特性分析较多，Palapala等[5]用新的分子生物学工具从基因角度分析不同品种金针菇的DNA。许峰等[6]通过SRAP引物分析了不同品种金针菇菌株之间的遗传关系。王守现等[7]通过菌种生长速度、菌丝生长势和生物转化率筛选适宜北京地区栽培的白色金针菇品种。由于上述方法均费时费力，建立一种简便快捷的鉴定方法为金针菇品种的选育及生产加工提供依据尤为重要。

顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）联用技术是将GC的分离特性与MS相结合检测样品中挥发性物质[8]。SPME-GC-MS技术的方便快捷已广泛用于各种食品和农产品的品种鉴定和质量分析，例如酒[9]、大米[10]、肉类产品[11]、蘑菇[12]、蔬菜水果[13]、烟草[14]和油脂[15]。该技术也曾用于食用菌品种的风味分析，陈万超等[16]利用SPME-GC-MS对12 个品种香菇的挥发性风味成分进行分析，并同时采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）进行数据分析。电子鼻技术可以模拟生物嗅觉，曾被用于研究食用菌的风味[17]。但电子鼻不仅受环境影响，还易受到气敏传感器灵敏度等方面的限制，其检测结果与期望值存在一定差距[18]，通常将其与其他技术结合使用。SPME-GC-MS可对挥发性成分的具体种类和含量进行定性定量分析，而电子鼻是分析样品中挥发性物质整体对风味特征的贡献，二者结合分析可以从宏观和微观上全面研究挥发性成分，该方法被证实能有效区分8 种商业蘑菇[19]，并且也可以对金针菇不同贮藏期的风味变化进行监测[20]。杨江等[21]通过GC-MS和电子鼻对襄阳地区腊肠进行香气成分测定，并采用PCA同时分析二者数据；Cui Shaoqiong等[22]采用PCA分别对不同年份人参GC-MS挥发性物质数据结合电子鼻数据进行了研究，结果显示多技术结合能更有效地区分样品组。然而，联用SPME-GC-MS和电子鼻鉴定金针菇品种的研究鲜见报道。

本研究采用SPME-GC-MS和电子鼻分析5 个品种金针菇挥发性物质，由定量分析、PCA、HCA探究不同品种金针菇挥发性物质差异，并通过SPME-GC-MS结合电子鼻进行PCA对比品种鉴定准确率，为不同品种金针菇的选育及后期的加工开发提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从四川省农业科学院获得的川金3号、川金11号、川金54号（以下简称3号、11号、54号）3 个品种金针菇样品，从江南生物科技公司获得的L4、L7两个品种金针菇样品。共获得5 个样品组，测定前将样品用液氮研磨。

正构烷烃（C7～C30）混和标准品 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C型GC-MS联用仪 美国安捷伦公司；50/30 µm DVB/CAR/PDMS固相萃取头 美国Supelco公司；FOX3000型电子鼻 法国Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 金针菇风味化合物SPME-GC-MS检测

按照Lauriezo等[23]的方法进行SPME-GC-MS分析。用液氮研磨后，准确地称量2.0 g金针菇样品于20 mL顶空瓶中。将DVB/CAR/PDMS型萃取头在250 ℃活化20 min后，在60 ℃水浴中进行静态吸附萃取40 min，将萃取头放入GC进样口解吸。

GC条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升温程序：初始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min升至230 ℃保持2 min。载气（He）流速为0.8 mL/min，分流比为1∶1。

MS条件：电子电离源；接口温度、四极杆温度和离子源温度分别为250 、150 ℃和230 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z25～450。

以正构烷烃的实际测量值校正保留时间，SPME-GCMS测定结果通过NIST 98数据库（NIST 08，华盛顿特区）进行检索，取匹配度80%以上的挥发性成分；以2-氯苯甲醛为内标物对各化合物进行定量分析。

1.3.2 金针菇风味化合物电子鼻检测

根据Yang Wenjian等[24]的方法进行电子鼻分析，并稍作修改。使用Alpha M.O.S.（法国）电子鼻系统测定金针菇样品中的挥发性风味物质。用液氮研磨后，精确称取2.0 g金针菇样品于20 mL顶空瓶内。样品测量流速150 mL/min，检测时间120 s。电子鼻配备12 个不同的气体传感器：LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2

和PA/2，通过传感器阵列响应和模式识别技术对挥发性气体分子进行分析。

1.3.3 特征挥发性物质的评定

根据刘登勇等[25]的方法，利用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）评定各挥发性化合物对样品总体气味的贡献，定义对样品风味贡献最大的组分：ROAVstan=100，则其他挥发性化合物的ROAV小于100，按下式计算[25]：

式中：Cri、Ti分别为各挥发性化合物的相对含量/%和气味阈值/（μg/kg）；Crstan、Tstan分别为对样品风味贡献最大组分的相对含量/%和气味阈值/（μg/kg）。

ROAV≥1的物质为该品种金针菇的特征挥发性物质；0.1≤ROAV＜1的物质对该品种金针菇整体风味有修饰作用，且ROAV越大说明该物质对该品种样品总体风味贡献越大[25]。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Stastics 23软件对SPME-GC-MS数据进行HCA，每组实验重复3 次，所得结果以表示。使用AlphaSoft V9.1及Origin 2018作雷达图及PCA图。

2 结果与分析

2.1 不同品种金针菇挥发性物质的SPME-GC-MS分析

2.1.1 SPME-GC-MS的定量分析

如表1所示，5 个品种金针菇样品中共检测出53 种挥发性成分，3号、11号、54号、L4和L7分别检测出21、29、21、12 种和18 种成分，其中醇类、醛类和芳香烃类占总含量的60%～95%，醇类和醛类化合物一般来自于脂质的氧化[26]，而芳香烃类化合物有独特的香味，对食用菌风味有重要影响[27]。不同品种金针菇仅有2 种共有挥发性成分，分别为1-己醇和2-十一烷酮。研究表明1-己醇具有花香和清澈的香味[26,28]。2-十一烷酮是柑橘类油性调味成分，用于调味品行业或驱虫剂[29]。每种金针菇都有3 种或3 种以上其他品种中不存在的化合物，3号、11号、54号、L4和L7中特有化合物数量分别为3、12、3、4 种和4 种。

表1 不同品种金针菇样品中挥发性化合物的相对含量Table 1 Relative contents of volatile compounds in different F. filiformis cultivars

续表1

表2 不同品种金针菇样品中挥发性成分及对应的ROAVTable 2 Volatile compounds and their ROAVs in different F. filiformis cultivars

如表2所示，辛醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、2-十一烷酮、2-甲基丁酸甲酯、D-柠檬烯为3号金针菇的特征挥发性物质（ROAV≥1），香叶基丙酮对3号金针菇的整体风味起修饰作用（0.1≤ROAV＜1）；1-己醇、反式-2-庚烯醛、辛醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、2-十一烷酮、香叶基丙酮、2-正戊基呋喃、D-柠檬烯为11号金针菇的特征挥发性物质（ROAV≥1），1-庚醇、1-辛醇对11号金针菇的整体风味起修饰作用（0.1≤ROAV＜1）；1-壬醇、辛醛、壬醛、癸醛、2-十一烷酮、D-柠檬烯为54号金针菇的特征挥发性物质（ROAV≥1），1-辛醇、反式-2-庚烯醛对54号金针菇的整体风味起修饰作用（0.1≤ROAV＜1）；1-壬醇、庚醛、辛醛、反式-2-辛烯醛、癸醛、2-十一烷酮、2-正戊基呋喃为L4金针菇的特征挥发性物质（ROAV≥1），1-己醇对L4金针菇的整体风味起修饰作用（0.1≤ROAV＜1）；反式-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、癸醛、2-十一烷酮为L7金针菇的特征挥发性物质（ROAV≥1），1-己醇、1-辛醇、反式-2-庚烯醛对L7金针菇的整体风味起修饰作用（0.1≤ROAV＜1）。

醇类化合物具有植物香气，是金针菇中主要的风味化合物之一，通常阈值较高，而不饱和醇阈值偏低，并随着碳链的延长，香气也会随之增加。5 种金针菇中共检测出5 种醇类化合物，存在于4 个品种金针菇中的1 种，是1-辛醇，具有柑橘果香[30]，属于八碳化合物，挥发性八碳化合物是大多数食用菌的主要挥发性成分[31]，这与大多数食用菌的挥发性成分研究结果一致[32]。1-庚醇和1-戊醇均只在11号金针菇中被检测到，且1-庚醇也是这种金针菇的特征风味物质之一。

醛类化合物也是金针菇特征风味化合物之一，气味浓烈，低、中和高碳位数的醛类分别具有刺激性气味、油脂味和柑橘皮的香味[27]。5 种金针菇中共检测出10 种醛类化合物，在4 种金针菇中被检测到的有3 种，分别为己醛、辛醛和癸醛，其中辛醛属于八碳化合物。己醛具有青草气味，是L4和54号金针菇中占比最高的化合物，相对含量分别为50.45%和16.30%，Malheiro等[33]曾在一种野生蘑菇中检测到高含量的己醛，可用于鉴定其品种。庚醛、苯乙醛和反,反-2,4-癸二烯醛分别是L4、3号和L7金针菇中特有化合物，庚醛具有强烈的油脂气味[34]，苯乙醛具有浓郁玉簪花香气味[35]，反,反-2,4-癸二烯醛具有强烈的鸡油香气[36]。

酸类化合物只在54号金针菇中被检测到，棕榈酸具有土壤气味，可与醇类物质发生反应形成酯类[37]，酯类化合物一般具有水果香气。5 种金针菇中共检测出7 种酯类化合物。其中只有邻苯二甲酸二异丁酯存在于2 种金针菇中，其他6 种化合物均属于特有化合物。邻苯二甲酸二异丁酯具有芳香气味，裴斐[32]在双孢蘑菇检测到过这种物质。酮类化合物通过不饱和脂肪酸或微生物的氧化以及氨基酸降解生成，具有花果香气[27]。5 种金针菇中共检测出3 种酮类化合物，共有的1 种，为2-十一烷酮。烯酮类来源于脂质的氧化加热，赋予金针菇似玫瑰叶的香气[27]。

烷烃类化合物一般气味阈值较高，对食用菌风味贡献率较小。5 种金针菇中共检测出6 种烷烃类化合物，特有化合物2 种，分别为壬烷和2,6,10,14-四甲基十六烷。芳香烃类化合物阈值较低，一般具有独特的香气，对食用菌风味贡献率较高，是5 种金针菇中种类最多且含有最多特有化合物的香气物质。雪松烯在3号金针菇中相对含量高达35.65%，该化合物曾作为主要风味物质在五味子挥发油[38]和芒果[39]中被检测出来，且发现它在茼蒿中的挥发性烯烃化合物中含量最高[40]。

杂环类、呋喃类和单环单萜类属于其他类化合物，5 种金针菇中共检测出5 种其他类化合物，独有化合物有2 种，分别为2-甲基-2-(1-甲基乙基)环氧乙烷和4,5,6,7-四氢-3,6-二甲基-苯并呋喃。甲氧基苯肟是一种含氮的杂环类，具有霉味和肉味[41]；氨基酸的美拉德反应、热分解反应，以及硫胺素的降解都是呋喃化合物的来源[42]，一般具有肉香味[31]；D-柠檬烯是一种单环单萜，具有果香橙子味[43]。

2.1.2 SPME-GC-MS的PCA

为了显示5 个品种金针菇样品组中53 种挥发性成分的差异，使用PCA对SPME-GC-MS进行分析。如图1所示，前2 个主要成分的贡献率是85.15%；PC1占52.31%，PC2占32.84%。PC1和PC2都明确区分了不同品种，5 个样本组相互之间很好地分开，说明不同品种金针菇间挥发性风味相互独立，且这2 个主成分可代表样品风味的主要特征。所有的挥发组分根据不同品种样品组也同样明显地区分开，其中，54号金针菇样品组与12 种化合物分布重叠，11号金针菇样品组与4 种化合物分布重叠。而其他3 个品种样品组虽然没有与化合物重叠，但四周都有各自相关的化合物。然而还是有很多比较分散的化合物，处于不同品种之间。这表明尽管使用53 种挥发性化合物也可以将品种区分开，但是金针菇的挥发性风味物质较复杂，并且在不同品种中有许多相似的物质，因此仅用SPMEGC-MS判别不同品种金针菇风味较为局限。

图1 不同品种金针菇样品基于SPME-GC-MS的PCAFig. 1 PCA plot of different F. filiformis cultivars based on SPME-GC-MS data

2.1.3 SPME-GC-MS的HCA

为了进一步分析SPME-GC-MS对于不同品种金针菇挥发性风味成分区分情况，将SPME-GC-MS数据进行HCA，结果如图2所示。从图2可以看出，不同品种金针菇挥发性成分的聚类树状图显示出3 个主要类别。其中，11号、54号和L7的样品被归为一类，而L4和3号的样本被分别归为其余两类。在第一大类中，11号和54号的样品在最小距离水平上首先聚类，这说明二者的样品挥发性成分相似度很高。随着欧式距离的增加，L7的样品也并入到这一类中。而当欧式距离增加至13时，L4与11号，54号和L7的样品归为一类。随着欧式距离的继续增大，当增至25时，三大类才归为一类。这与2.1.2节结果一致。HCA差异主要由不同品种中各类化合物种类和含量不同造成。结合表1可知，由于醇类、醛类和芳香烃类物质占所检测总物质的60%～95%，因此影响样品聚类的主要因素是三者的相对含量。

图2 不同品种金针菇样品的HCAFig. 2 HCA of different cultivars of F. filiformi

2.2 不同品种金针菇挥发性物质的电子鼻分析

2.2.1 电子鼻的雷达指纹图分析

图3 不同品种金针菇样品中挥发性化合物的雷达指纹图Fig. 3 Radar fingerprint charts of volatile compounds in different F. filiformis cultivars

将电子鼻数据作雷达图，如图3所示，显示12 个传感器对5 个不同品种金针菇样本组的响应。传感器PA/2、T70/2、P40/1、P10/2、P10/1和T30/1对L7金针菇的挥发性气味响应值最高；传感器LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL和LY2/gCT对3号金针菇的挥发性气味响应值较高；传感器LY2/LG对5 种金针菇样品的挥发性气味响应值相似。3号和L4响应值的轮廓相似，表明两者的香气成分接近，但是PA/2、T70/2、T30/1对3号和L4品种的金针菇样品响应值可以明显区分这2 种金针菇。其余3 种金针菇样品响应值的轮廓相似，说明这几个品种的金针菇样品的香气成分接近，但是LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL对11号、54号、L7品种的金针菇样品响应值可以明显区分这3 种金针菇。

2.2.2 电子鼻的PCA

图4 不同品种金针菇样品基于电子鼻的PCAFig. 4 PCA of different cultivars of F. filiformis based on E-nose data

将电子鼻数据作PCA，如图4所示，累计贡献率为99.87%，其中PC1占97.10%，PC2占2.77%。结果显示，5 个品种金针菇被明显地区分开。对比图4与图1，发现通过电子鼻PCA的数据集分布更类似于基于SPME-GC-MS的53 种挥发性化合物的分布，而电子鼻能将所有品种很好地区分且使其成团，说明电子鼻数据稳定性和重复性较好，可以辅助SPME-GC-MS数据分析不同品种金针菇挥发性物质。

3 结 论

通过SPME-GC-MS分析，5 个品种金针菇样品中共检测出53 种挥发性成分，3号、11号、54号、L4和L7分别检测出21、29、21、12 种和18 种成分，其中，最主要的是醇类、醛类和芳香烃类。根据ROAV≥1确定各金针菇中特征挥发性物质，SPME-GC-MS可以有效区分不同品种，不同品种特征性挥发性物质种类和含量不同。电子鼻能将所有品种有效区分且使其成团，说明电子鼻数据稳定性和重复性较好，可以辅助SPME-GC-MS数据分析不同品种金针菇挥发性物质。因此，可使用SPME-GCMS技术结合电子鼻技术对金针菇不同品种的挥发性物质进行综合分析和鉴别，为不同品种金针菇的选育及后期的加工开发提供一定参考依据。