紫菜粉添加对鱿鱼鱼糜凝胶特性及其蛋白结构的影响

徐安琪，杨 镕，朱煜康，盛珍珍，宋琳璐，贾 茹，黄 涛，杨文鸽

（宁波大学食品与药学学院，浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211）

据测算，世界大洋中头足类资源的总储量近1亿 t，目前全球头足类的年捕捞量约360万 t，其中70%左右是鱿鱼，也是我国重要的水产品加工原料之一。目前鱿鱼主要通过速冻、烘焙等，加工成冷冻鱿鱼块、鱿鱼圈和即食鱿鱼丝，产品比较单一。鱿鱼肉厚色白、组织细腻、无骨刺、无腥味等，十分适合各种鱼糜制品的加工。但秘鲁鱿鱼肉往往含有不受人欢迎的酸涩味，而且富含内源性蛋白酶，对肌原纤维蛋白产生降解，不易形成凝胶强度高、保水性好的鱼糜凝胶，大大制约了鱿鱼鱼糜制品的开发。有关鱿鱼鱼糜凝胶特性的改进研究有较多报道，但主要集中在淀粉、蛋白类添加剂及超高压前处理对凝胶特性的影响。如郭颖等[1]发现添加0.3%～2.0%的转谷氨酰胺酶可提高鱿鱼鱼糜凝胶硬度和弹性；Kuwahara等[2]认为柠檬酸钠能抑制鱿鱼肌肉蛋白的自溶活性，改进鱿鱼肉凝胶特性；王冬妮等[3]研究表明红薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉可改善鱿鱼鱼糜的凝胶特性；郑炜[4]以秘鲁鱿鱼为原料，研制开发高水分风味鱼粒。

紫菜是我国大规模养殖的重要经济海藻，是一种高蛋白、高纤维、低热量、富含矿物质的藻类。但目前对紫菜深加工工艺的研究仍然有限，与紫菜加工发达的国家差距较大[5-6]。紫菜粉富含海藻多糖等活性成分，具有较好的凝胶增强和吸水能力，常被用作稳定剂、增稠剂、乳化剂和胶凝剂，将其与鱼糜混合，能改善鱼肉肌原纤维蛋白凝胶特性，提高制品保水能力，同时符合荤素搭配的食品营养原则。Alipour等[7]研究发现添加海藻粉和硫酸多糖延长鱼糜重组产品的货架期；吴佳莉等[8]在鱼糕中添加海带浆，产品各项性能较好；孙玥等[9]以比目鱼鱼糜、海带丝为原料制得的鱼丸营养丰富，风味独特；胡巧云[10]以孔石莼超微粉为辅料，探究孔石莼的前处理方法、粒度和添加量等因素对鱼丸品质的影响。但有关将海藻粉添加到鱿鱼鱼糜中，研究紫菜粉对鱿鱼鱼糜凝胶特性影响的研究鲜见报道。

本研究将紫菜粉与鱿鱼鱼糜混合，探究不同紫菜粉添加量对鱿鱼鱼糜凝胶感官、色泽、凝胶强度和持水性的影响，确定较优的紫菜粉添加量区间，并通过圆二色谱（circular dichroism，CD）、傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）分析紫菜粉对鱿鱼肌原纤维蛋白二级结构和鱼糜蛋白构象的影响，结合扫描电镜观察凝胶微观结构，探讨紫菜粉改善鱿鱼鱼糜凝胶的机理，旨在为紫菜应用于鱿鱼鱼糜及其制品的生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秘鲁鱿鱼鱼糜由宁波飞润海洋生物科技股份有限公司提供，-40 ℃冻藏备用；新鲜紫菜 宁波市鄞州藤叶海藻专业合作社；辅料为马铃薯淀粉、蛋清粉、食用油、白糖、料酒、食盐、生姜粉 宁波欧尚超市。

1.2 仪器与设备

UMC5真空斩拌机 德国Stephan Machinery公司；CR-400色差仪 日本Konica Minolta公司；Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机 德国Thermo Scientific Sorvall公司；TA.XT Plus食品物性测试仪 英国Stable Micro Systems公司；FT/IR-6300 FTIR仪、J-1500-150 CD仪日本分光株式会社。

1.3 方法

1.3.1 紫菜预处理和鱿鱼凝胶化鱼糜、鱼糜凝胶的制备

取适量紫菜，105 ℃烘干后粉碎过200 目筛，得到紫菜粉。根据GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》和蒽酮-硫酸法，分别测得紫菜粉蛋白质质量分数为33.69%，多糖质量分数为18.24%。鱿鱼鱼糜4 ℃解冻，置于真空斩拌机中低温空斩2 min，添加2%食盐斩拌8 min，加入紫菜粉（添加量分别为0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，以鱿鱼鱼糜质量计）、马铃薯淀粉、蛋清粉、食用油、白糖、料酒、食盐、生姜粉等辅料继续斩拌8 min，加入冰水，将水分质量分数调节至75%。全程温度控制在10 ℃以下。斩拌后的鱿鱼鱼糜立即灌入直径25 mm、长度100 mm左右的肠衣，两头扎紧。鱿鱼鱼糜凝胶经二段式加热后冷却制成，即40 ℃加热30 min（低温段加热）得到凝胶化鱼糜，再于90 ℃加热30 min（高温段加热），并立即置于冰水中冷却30 min得到鱼糜凝胶，不添加紫菜粉组为对照组。4 ℃保存，取样测定各项指标。

1.3.2 感官评定

鱿鱼鱼糜凝胶切片（5 mm厚），室温平衡30 min，由10 位经感官评定培训人员组成品评小组，从组织状态、色泽、气味、弹性、口感5 个方面进行评价[11]，评定标准见表1。采用加权法计算总分，各项指标取平均值。

表1 感官评定标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of surimi

1.3.3 白度的测定

鱿鱼鱼糜凝胶切片（3 mm厚），使用色度仪测量L*（亮度）、a*（红色/绿色）和b*（黄色/蓝色）值。白度按式（1）计算[12]：

1.3.4 凝胶强度和持水性的测定

鱿鱼鱼糜凝胶切成圆柱体（直径和厚度均为25 mm），采用P/0.5S的球形探头，使用食品物性测试仪测定。测定参数：测前速率1.0 mm/s，穿刺速率1.0 mm/s，测后速率10.0 mm/s。

离心法测定持水性[13]：准确称取3 g鱿鱼鱼糜凝胶样品（W1，g），置于2 层滤纸间包裹好，放入50 mL离心管离心（5 000 r/min、4 ℃）15 min，立即取出样品称其质量（W2，g）。持水性按式（2）计算：

1.3.5 鱼糜蛋白结构分析

参照Guan Aiyan等[14]方法。取对照组、0.4%组和0.6%组鱿鱼鱼糜、凝胶化鱼糜、鱼糜凝胶干燥样品，并分别与溴化钾粉末1∶100混匀压片，利用红外光谱仪扫描（400～4 000 cm-1）。

1.3.6 凝胶微观结构的观察

取对照组、0.4%组和0.6%组鱿鱼鱼糜凝胶，切成约1 mm3小块，2.5%戊二醛固定，24 h后用磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.2）漂洗3 次，依次用30%、40%、50%、70%、80%、90%及无水乙醇梯度洗脱，随后按无水乙醇-叔丁醇3∶1、1∶1、1∶3比例及纯叔丁醇依次洗脱，最后用少量叔丁醇覆盖样品，冷冻干燥，贴样、镀金后用扫描电镜观察。

1.3.7 肌原纤维蛋白提取及含量测定

参考Xiong Guangquan等[15]方法。分别取对照组、0.4%组和0.6%组鱿鱼鱼糜、凝胶化鱼糜、鱼糜凝胶各2 g于离心管中，加10 倍量20 mmol/L Tris-maleate缓冲液（含0.05 mol/L KCl，pH 7.0），匀浆后冷冻离心（10 000 r/min，10 min），沉淀加入10 倍量20 mmol/L Tris-maleate缓冲液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0），充分匀浆，静置1 h后10 000 r/min冷冻离心10 min，上清液即为肌原纤维蛋白溶液。冷冻干燥，得到肌原纤维蛋白粉末，采用福林-酚法测定肌原纤维蛋白含量。

1.3.8 肌原纤维蛋白二级结构的分析

参照Guan Aiyan等[14]方法。取对照组、0.4%组和0.6%组鱿鱼鱼糜、凝胶化鱼糜、鱼糜凝胶中提取的肌原纤维蛋白粉末，加水配制成0.2 mg/mL蛋白溶液。采用CD仪，选用光径为1 mm的石英样品池，在远紫外区（190～250 nm）对肌原纤维蛋白溶液进行扫描，扫描速率为50 nm/min，响应时间0.25 s，以蒸馏水作为空白。

1.3.9 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分离肌原纤维蛋白

参考Lv Mingchun等[16]方法。分离胶和浓缩胶体积分数分别为15%和5%，每孔样品（对照组、0.4%组和0.6%组鱿鱼鱼糜、凝胶化鱼糜、鱼糜凝胶中提取的肌原纤维蛋白溶液）上样量为5 μL。起始电压100 V，待溴酚蓝移至浓缩胶与分离胶的交界处改为80 V，考马斯亮蓝R-250染色，凝胶成像仪拍照。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 紫菜粉添加量对鱿鱼鱼糜凝胶感官质量评分的影响

表2 紫菜添加量对鱿鱼鱼糜凝胶感官质量评分的影响Table 2 Effect of laver powder addition on the sensory evaluation of squid surimi gel

由表2可见，不同紫菜粉添加量对鱿鱼鱼糜凝胶感官影响显著（P＜0.05），随着添加量的增加，唯有弹性逐渐减小，而组织状态、色泽、气味和口感都呈先增加后下降的趋势，并分别在添加量0.6%、0.4%、0.8%和0.6%处达到最大值。当紫菜粉添加量为0.4%时，感官质量总分最高，此时鱿鱼鱼糜凝胶切面结构紧密、无气孔，表面有光泽，带有鱿鱼和紫菜特有风味，口感比较细腻。添加量为0.8%或更高时，除气味外，产品各项指标呈现劣化趋势，可能是因紫菜含量过多会破坏蛋白凝胶结构或紫菜中的不溶性纤维与肌纤维蛋白竞争水分引起的品质下降。结合感官分析，紫菜粉添加量以0.4%～0.6%左右为佳。

2.2 紫菜粉添加量对鱿鱼鱼糜凝胶色泽的影响

如表3所示，添加紫菜粉对鱿鱼鱼糜凝胶色泽影响显著。添加紫菜粉后，L*和a*值显著下降，b*值显著上升（P＜0.05）。推测是因为紫菜粉中的色素类物质使肉糜色泽发生变化[17]。紫菜粉添加量达到0.6%时，a*和b*值不再随着添加量的升高而显著改变，而L*值和白度仍呈显著下降趋势（P＜0.05）。L*值反映样品的光亮度，数值越小，鱼糜凝胶表面越暗淡，a*值降低和b*值升高表明鱿鱼鱼糜凝胶的色泽朝偏绿偏黄的方向发展（图1），这主要受紫菜粉本身颜色影响。

表3 紫菜粉添加量对鱿鱼鱼糜凝胶色泽的影响Table 3 Effect of laver powder addition on the color of squid surimi gel

图1 添加不同量紫菜粉的鱿鱼鱼糜凝胶Fig. 1 Squid surimi gels with the addition of different concentrations of laver powder

2.3 紫菜粉添加量对鱿鱼鱼糜凝胶强度和持水性的影响

凝胶强度和持水性都是评价鱼糜凝胶品质的重要指标。持水性越高，表明鱼糜凝胶的网络结构对水分等物质的束缚能力越强，蛋白质网络结构越致密，凝胶强度就越大[18]。

图2 紫菜粉添加量对鱿鱼鱼糜凝胶强度和持水性的影响Fig. 2 Effect of laver powder addition on the gel strength and WHC of squid surimi gel

由图2 可知， 对照组样品的凝胶强度是1 112.21 g·cm，紫菜粉添加组较对照组凝胶强度显著提高（P＜0.05），随着添加量的增加，凝胶强度呈先上升后下降的趋势，其中0.4%组达到最大值1 567.02 g·cm。这是因为在凝胶化过程中，加热促使鱿鱼鱼糜蛋白分子基团暴露，添加适当的紫菜粉，紫菜中的多糖、蛋白与暴露的鱼糜蛋白基团发生相互作用，有利于形成稳定的三维网络结构；同时紫菜粉所含的多糖具有较强的吸水性，吸水后通过氢键相互作用，使凝胶结构更加稳固。这与李德海等[19]研究的多糖类物质能提升肉类制品的凝胶强度结果相一致。当紫菜粉添加量大于0.6%时，凝胶强度有所下降，这可能是由于紫菜中一些不溶性组分（如不溶性膳食纤维等）阻碍了多糖与蛋白分子之间的相互作用。Debusca等[20]研究表明纤维素粉添加量低于6%时，可以增强阿拉斯加鳕鱼鱼糜强度，而添加量大于6%时凝胶的破断力和破断距离显著下降。

紫菜粉添加后持水性显著提高（P＜0.05），原因在于紫菜含有丰富的多糖，具有较强的吸收和保留水分的能力[21]。紫菜粉添加量在0.4%时，鱼糜凝胶持水力升高幅度较大，随后持水力升幅不显著（P＞0.05）。Tolano-Villaverde等[22]发现在pH 7.0条件下，用2%壳聚糖处理可提高鱿鱼鱼糜凝胶的保水能力；王希希等[17]认为蛋白质-多糖的结合达到一定饱和状态后，继续提高麒麟菜添加量，鸡胸肉糜凝胶的持水性变化不显著。一般地，持水性好的鱼糜凝胶具有较高的弹性和凝胶强度[23]，本实验中当紫菜粉添加量大于0.6%时，持水性和凝胶强度的变化趋势并不一致，原因可能是过多的紫菜粉与鱼糜蛋白相互作用，相应的减少了鱼糜蛋白与水的作用，导致蛋白结合的水分减少[24]。综合鱿鱼鱼糜凝胶强度和持水性，0.4%和0.6%都是较适的紫菜粉添加量。

通过上述指标，可以看出0.4%和0.6%组鱿鱼鱼糜凝胶强度和持水性分别达到或接近峰值，凝胶品质得到改善，因此后续取对照组、0.4%组和0.6%组鱿鱼鱼糜、凝胶化鱼糜和鱼糜凝胶，分析凝胶化过程中鱼糜蛋白构象、肌原纤维蛋白组成及其二级结构、鱼糜凝胶微观结构，进一步探究紫菜粉改善鱿鱼鱼糜凝胶品质机理。

2.4 鱼糜蛋白的FTIR分析

如图3 所示，样品在红外区出现若干特征吸收峰，可反映蛋白质二级结构的变化趋势。其中酰胺I带（1 600～1 700 cm-1），酰胺II带（1 500～1 600 cm-1），酰胺III（1 220～1 330 cm-1）都有吸收峰出现。

在凝胶化过程中，鱼糜蛋白中反映α-螺旋特征的吸收峰向低波数偏移，其中对照组由1 654、1 650 cm-1至1 638 cm-1，0.4%组由1 658、1 650 cm-1至1 638 cm-1，0.6%组由1 653、1 650 cm-1至1 637 cm-1，说明凝胶化过程中鱼糜蛋白α-螺旋转变为β-折叠结构，这与后续CD图谱结果一致。酰胺II带的特征吸收峰由60%的N—H弯曲振动和40%的C—N伸缩振动引起，凝胶化过程中，对照组在1 542 cm-1附近的酰胺II带无明显变化，而0.4%组和0.6%组酰胺II带峰形逐渐变宽，表明紫菜粉促进了凝胶化过程中N—H弯曲或C—N伸缩振动的变化，并进一步影响鱼糜蛋白结构的变化。对照组、0.4%组和0.6%组在1 240 cm-1附近的酰胺III带均无明显变化，40 ℃和90 ℃加热后，850 cm-1附近的肌球蛋白侧链酪氨酸残基的峰形较为尖锐。可见在凝胶化过程中，蛋白之间相互交联，鱼糜蛋白的疏水性残基暴露，表面疏水性增加，而疏水相互作用是蛋白质发生折叠时的主要推动力，对稳定肌原纤维蛋白网络结构发挥重要作用[25]，这与邓丽等[26]在研究热加工过程中鲍鱼腹足冻干样品蛋白FTIR变化的结果相似。

图3 凝胶化过程中鱼糜、凝胶化鱼糜、鱼糜凝胶的FTIR图Fig. 3 Changes in FTIR spectra of surimi with the addition of different concentrations of laver powder during gelation

2.5 鱼糜凝胶显微结构的分析

图4 鱿鱼鱼糜凝胶微观结构图（×10 000）Fig. 4 Microstructures of squid surimi gels with the addition of different concentrations of laver powder (× 10 000)

如图4所示，对照组鱼糜凝胶网络结构比较松散，表面粗糙，孔洞大小不均一，而紫菜粉的添加使鱿鱼鱼糜凝胶网络孔径变小，三维结构更加紧凑，孔洞大小和分布比较均匀。这是因为加热促进蛋白质或海藻多糖暴露出更多的基团，二者之间的相互作用增强，从而加固凝胶网络结构，增强对水分的束缚能力，并进一步增加凝胶强度。Zhuang Xinbo等[27]发现一定量不溶性膳食纤维有利于肌原纤维蛋白凝胶形成均匀致密的三维网络结构。此外与0.6%组相比，0.4%组鱼糜凝胶的微观结构更加致密，可能的原因是紫菜粉添加量过高，会因为不溶性纤维的增加而阻碍蛋白质之间的交联，对网络结构存在一定的负面影响。张高楠等[28]研究当归对乌鳢肌原纤维蛋白微观结构的影响也有相似的结论。

2.6 肌原纤维蛋白的CD分析

蛋白质的圆二色性是肽键的相互作用引起的，其吸收范围在波长190～250 nm，因此常用该波长范围测量蛋白质的CD[29]。图5为不同紫菜粉添加后凝胶形成过程中肌原纤维蛋白的CD图，其二级结构含量如图6所示。

在209～222 nm波长范围内出现的双槽曲线是α-螺旋结构的特征吸收峰[29]。由图5可知，肌原纤维蛋白在209 nm和220 nm附近存在2 个负凹槽，表明存在α-螺旋。在凝胶化过程中，对照组肌原纤维蛋白主要呈现α-螺旋和β-转角结构减少、β-折叠结构增加的趋势，其中α-螺旋、β-转角相对含量分别下降5.1%、6.6%，而β-折叠含量上升14%；紫菜粉添加组也呈现α-螺旋含量下降、β-折叠含量上升的趋势，而β-转角和无规卷曲变化不明显。刘海梅等[30]研究发现，高温蒸煮过程中鲢鱼肌球蛋白α-螺旋含量减少，并转变为β-折叠；陈燕婷等[31]发现凝胶化过程中带鱼鱼糜蛋白紧密的螺旋结构向无规则状态转变；吴烨[32]用CD测定兔肌球蛋白的二级结构，发现在加热过程中α-螺旋转变成β-折叠和无规卷曲。在鱿鱼鱼糜热凝胶化过程中，α-螺旋含量降低代表蛋白分子展开程度增加，而β-折叠含量增加代表蛋白分子间聚集程度增加，说明加热促进肌原纤维蛋白分子展开，α-螺旋结构部分展开并重排成β-折叠结构。加热变性后，蛋白质分子中α-螺旋和β-转角会转变为β-折叠，由此推测β-折叠结构的形成也是鱿鱼鱼糜蛋白聚集和形成凝胶网络结构的前提条件[33]。

低温段加热后，与对照组相比，0.4%组和0.6%组凝胶化鱼糜肌原纤维蛋白的α-螺旋结构分别上升2.4%和9.1%，β-折叠结构分别下降7.3%和7.6%，β-转角结构中0.4%组上升3.4%，0.6%组下降0.2%，而无规卷曲相对含量无显著变化；进一步通过90 ℃高温段加热，与对照组相比，0.4%组和0.6%组鱼糜凝胶中肌原纤维蛋白的α-螺旋含量分别上升1.2%和5.1%，β-折叠含量分别下降2.7%和3.2%，β-转角结构中0.4%组上升1.4%，0.6%组下降0.1%，而无规卷曲含量变化不显著。由此可见，与对照组相比，各紫菜粉添加组的凝胶化鱼糜、鱼糜凝胶中肌原纤维蛋白中α-螺旋的相对含量增加，β-折叠的相对含量降低，其中0.4%组β-转角的相对含量增加。结合鱼糜凝胶的持水性和凝胶强度在0.4%和0.6%组均达到峰值，说明α-螺旋和β-转角结构的相对含量与凝胶强度和持水性存在一定相关性。相比于伸展的β-折叠构象，α-螺旋和β-转角结构的空间排列更为紧密，有利于更多的水分被截留，从而使凝胶网络结构更稳固，同时也进一步解释了0.4%组鱼糜凝胶微观结构更加致密的原因。费英等[34]认为猪肉肌原纤维蛋白的α-螺旋含量高低与其热诱导凝胶的持水性呈正相关；王未君[33]研究发现魔芋胶有利于猪肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶过程中蛋白α-螺旋结构的保留，从而有利于增强凝胶保水性；张高楠等[28]通过红外光谱发现，1%和2%的当归粉添加量使肌原纤维蛋白的α-螺旋结构比例较对照组增大，有更高的保水性，本实验结果与这些结论一致。由此推测，在鱿鱼鱼糜凝胶化过程中，加热促进肌原纤维蛋白α-螺旋结构部分展开，并重排成β-折叠，而紫菜粉的添加则有利于热凝胶化过程中肌原纤维蛋白α-螺旋和β-转角结构的保留，增强鱼糜凝胶强度及其持水性。

2.7 肌原纤维蛋白的SDS-PAGE分析

如图7所示，其中分子质量200 kDa左右条带为鱿鱼肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC），97 kDa左右条带为软体动物特有的副肌球蛋白（paramyosin，PM），43 kDa左右条带为肌动蛋白（actin，AC）[35]。

图7 肌原纤维蛋白的SDS-PAGE图Fig. 7 SDS-PAGE patterns of MP in squid surimi gels with the addition of different concentrations of laver powder during gelation

40 ℃低温段加热后得到凝胶化鱼糜，其MHC条带明显减弱，高温段加热后条带几乎消失，推测凝胶化过程中MHC通过分子间的共价键交联成聚集，聚集体因分子过大无法进入分离胶，且有研究表明低温凝胶化阶段肌球蛋白的交联和凝胶强度存在明显的相关性[36-37]。与对照组相比，90 ℃高温段加热后，0.4%组和0.6%组MHC、PM和AC强度均有一定程度减弱，说明紫菜粉不仅促使MHC相互交联，同时也可使AC和PM与之交联，形成具有稳定三维网络结构的凝胶，这与鱿鱼鱼糜凝胶强度和持水性的变化结果基本一致。

3 结 论

在鱿鱼鱼糜中添加适量的紫菜粉，兼有鱿鱼和紫菜独特风味，同时鱼糜凝胶强度和持水性显著增强，这与紫菜粉中的多糖、蛋白具有较强的吸水能力，并与鱼糜蛋白分子相互作用有关。在热凝胶化过程中，鱿鱼鱼糜肌原纤维蛋白的二级结构有所转变，而紫菜粉的加入有利于鱼糜凝胶保留更多的α-螺旋和β-转角结构，增加截留水分的能力；电镜结果显示，紫菜粉的加入使鱼糜凝胶网络孔径变小，结构更加致密。但过量添加紫菜粉，会削弱鱼糜肌原纤维蛋白之间的交联作用，引起凝胶强度下降。综合来看，在鱿鱼鱼糜中添加0.4%～0.6%紫菜粉，可有效改善其凝胶品质，为丰富鱼糜制品市场提供理论依据。