口腔鳞癌Survivin 表达的临床意义与PCNA 关系研究*

于肖鹏 李晓光 苏庆琪 刘 桐 李腾宇 王延秀

口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是目前临床上常见的恶性肿瘤，现阶段治疗此病的最有效方法仍然是肿瘤手术切除，现在其预后不良的原因主要是肿瘤发生淋巴结转移及局部复发[1]，其转移复发的原因之一是OSCC 细胞的恶性增殖。Survivin 基因既有抑制肿瘤细胞凋亡作用，还有调节肿瘤细胞周期的有丝分裂作用，其具有的双重功能成为目前研究的热点[2]。增殖细胞核抗原(Pr oliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)作为DNA 聚合酶的一种辅助性蛋白，能够反应出细胞的生长增殖情况[3，4]。本研究课题通过免疫组化的实验方法，测定PCNA 和Survivin 蛋白在口腔鳞癌中的表达，研究Survivin 表达的意义，以及与PCNA 表达的相关性。

1.材料与方法

1.1 临床资料及切片制备 OSCC 标本共106例，来自2007 年1月至2017 年12月我院颌面外科病房手术切除组织，患者年龄34～78 岁，平均60.6 岁，其中女性41 例，男性65 例。根据术后病理检查结果判断颌颈部的淋巴结是否发生转移。10 例正常口腔黏膜，取自口腔黏膜外伤组织。选取的106 例患者术前均未进行化学治疗或放射治疗，临床分期按照TNM 国际统一分期方法(UICC)分组，其中Ⅰ期14 例，Ⅱ期为29 例，Ⅲ期38 例，Ⅳ期为25 例。组织病理学分级为：1 级33 例，2 级为51 例，3 级为22 例。具体肿瘤部位为：舌癌41例，牙龈癌为30 例，颊癌13 例，硬腭癌为8 例，口底癌14 例。免疫组化染色方法采用抗PCNA 和Survivin 单克隆抗体，分别对OSCC 切片染色。同时进行常规HE 染色。

1.2 免疫组织化学染色 染色试剂DAB 由Sigma 公司提供，PCNA 及Survivin 单克隆抗体由武汉博士德公司提供。按照试剂说明以SABC免疫组织化学法常规操作。阳性对照分别用已知Survivin 及PCNA 阳性的乳腺癌切片作对照，阴性对照采取第一抗体用PBS 替代作对照，用DAB显色，再用苏木精复染。

1.3 Survivin 蛋白表达的判断标准 肿瘤细胞质内含有棕褐色样颗粒即视为阳性染色(图1)。每张切片有10%以上的癌细胞表现为弱、中等着色强度[5]，即判断为Survivin 表达阳性。

图1 Survivin 阳性细胞浆内含有棕色颗粒(免疫组化DAB 染色×400)

1.4 PCNA 标记指数(PCNA Label index，PLI)的计算方法 肿瘤细胞核有棕褐色染色即视为PCNA染色阳性(图2)。选取500 个肿瘤细胞计数其中PCNA 阳性细胞数量，其所占百分数则为PLI。

图2 PCNA 阳性细胞核内含有棕褐色颗粒(免疫组化DAB 染色×400)

1.5 统计学分析 实验数据采用SPSS17.0 统计学软件包分析，Survivin 表达与PLI 和临床因素关系的判断使用卡方检验。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 Survivin 的表达及PLI 检测结果 74 例肿瘤组织Survivin 染色呈阳性，阳性率为69.81%。正常口腔黏膜组织中无表达，二者差异显著(X2=19.28，P＜0.01)。PLI 值为16.1%～96.2%，平均值为(55.01±22.02)%，以PLI 平均值分为低56 例(16.1%～56.15%)、高50 例(56.15%～96.2%)两组进行统计分析。

2.2 肿瘤组织中Survivin 蛋白表达与病理因素关系 Survivin 的蛋白表达量与OSCC 的淋巴结转移、病理分级和TNM 分期密切相关(P＜0.01)，见表1。

表1 Survivin 表达与临床病理因素的关系(例数)

2.3 肿瘤组织中Survivin 表达与PCNA 的关系 Survivin 表达阳性的口腔鳞状细胞癌组，其PLI 值明显高于Survivin 表达阴性组，两者表达明显正相关(P＜0.01)，结果见表2、图3、图4。

表2 Survivin 表达与PCNA 的关系

图3 Survivin 表达与PLI 值高低线图

图4 Survivin 表达与PLI 值高低线图

3.讨论

在细胞的DNA 中，存在着凋亡基因及抑制凋亡基因，正常情况下，两者处于平衡协调状态，维护着细胞的生死秩序。目前发现的众多凋亡抑制因子中，Survivin 是作用最强的因子，在人类所有肿瘤组织中，几乎都发现了其表达，它可以抑制多种细胞凋亡基因诱导的肿瘤凋亡，通过抑制抗癌药物的凋亡诱导，降低药效[6]，且促使恶性肿瘤细胞的生长增殖。Survivin 在细胞增殖G2/ M 期选择性表达，同时具有细胞周期的特异性，在细胞的有丝分裂期，纺锤轴的微管可以与Survivin 进行结合，而微管的运动又可以调节Survivin 的表达水平，Survivin 过度表达时，就很难与结合的微管分离，这时候就可以出现其持续的抗凋亡效果。由此认为在细胞G2/ M 期，Survivin 通过抑制凋亡诱导，促进细胞的异常生长增殖[7]。多项报道认为其可作为肿瘤预后不良的标志[8-10]。

本结果表明，其Survivin 蛋白表达阳性率是69.81%，在高分化组是48.48%，而中低分化组高达79.45%，两组之间差异显著(P＜0.01)，说明随着肿瘤分化程度降低，Survivin 的凋亡抑制作用更强，表达与病理分级相关。同时Survivin 表达和临床分期也相关(P＜0.01)，在口腔鳞癌发病的后期其表达更强。本组Survivin 表达阳性患者，其颈部淋巴结发生转移的机率大于阴性者(P＜0.01)，二者密切相关，同多数其他学者研究相似[11，12]。由此说明Survivin 的过高表达可以抑制细胞凋亡，促进肿瘤的无限制生长。肿瘤发生死亡的原因约85%～95%是其转移引起[13]，临床研究显示口腔鳞癌晚期更易出现转移，且与肿瘤的大小相关[14]。说明检测口腔鳞癌Survivin 蛋白的表达对预后判断有明显指导作用，靶向Survivin 基因治疗，将提供口腔癌治疗的新途径。

PCNA 蛋白的表达与细胞的生长增殖周期一致[15]，常作为细胞增殖生长活性的指标[4，16]。已有多项临床及动物实验研究提示，PCNA 表达与口腔癌的病理分型和颈部淋巴结转移关系密切[17，18]，可以作为其预后的指标之一。本项研究表明在Survivin表达阳性者中，PLI 值明显高于阴性者，差异显著(P＜0.01)，两者的表达明显相关，说明Survivin蛋白一方面调控肿瘤凋亡，同时促进肿瘤增殖。目前口腔癌治疗的最有效方法仍然是手术切除，本项研究提示肿瘤切除标本若survivin 和PCNA 都阳性表达，表明预后不良，应该进行术后放疗和巩固性治疗，并且术后密切随访。手术前在进行肿物活检时，建议同时进行survivin 和PCNA 检测，阳性者应考虑进行根治性切除。