miR-411-5p 在结直肠癌中的表达及其细胞生物学功能分析

易深根 刘波 郑瑛 甘伟 刘奎杰 曾嘉 曾蓉 陈翔 欧阳国庆 陈卫东（通讯作者）

（中南大学湘雅二医院 湖南 长沙 410000）

结直肠癌是临床中发病率及死亡率均较高的一种恶性肿瘤，其中复发转移是患者死亡的重要原因[1]。由于结直肠癌早期缺乏典型临床症状，且临床上缺乏早期诊断的特异性生物分子标志物，因而大多数患者确诊时已经处于中晚期。近年来，随着分子检测手段的不断发展进步，恶性肿瘤相关基因表达情况已经成为临床研究的一个热点。微小RNA（mi-RNA）具有多种生物学功能，包括调节细胞增殖、迁移、死亡、组织代谢、个体发育以及神经细胞分化等[2]。研究显示[3]，miR-411-5p 在膀胱癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌中均出现异常表达。本研究通过实时荧光定量PCR（Q-PCR）对结直肠癌组织及癌旁组织中miR-411-5p表达情况进行检测，旨在分析其与临床病理特征的关系，及其对细胞生物学功能的影响。现将结果报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取医院2019 年1 月—2020 年4 月接受手术治疗的结直肠癌患者50 例作为研究对象，手术切除患者结直肠癌组织作为结直肠癌组，选取距病灶边缘＞5cm 的癌旁组织作为癌旁组，所有癌旁组织均经术后病理学检查无癌组织残留。详细收集患者的一般资料，主要包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、TNM 分期、组织分化程度、淋巴结转移。50 例患者中男性29 例，女性21 例；年龄34 ～78 岁，平均年龄（60.29±7.46）岁；肿瘤部位：直肠26 例，结肠24 例；TNM 分期：Ⅰ期11 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期8 例；有淋巴结转移21 例，无淋巴结转移29 例。

1.2 方法

1.2.1 材料及仪器 结直肠癌细胞株DLD1 购自中国科学院细胞库，荧光定量PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司，靶基因引物、RPMI-1640、胎牛血清购自美国HyClone 公司，逆转录试剂盒、转染试剂盒、miR-411-5p negative、miR-411-5p mimic 由上海吉玛公司提供。

1.2.2 Q-PCR 测定miR-411-5p 相对表达量 取大小适宜的结直肠癌组织和癌旁组织，通过TRizol 法提取RNA，浓度测定之后使用逆转试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，取1μL 的cDNA，通过PCR 试剂盒扩增及检测miR-411-5p 的表达，以2-ΔΔCt 计算miR-411-5p 相对表达量。PCR 反应体系总体积为20μl，PCR 扩增：95℃预变性，时间为5min，变性40s，退火至60℃，时间维持40s，再延伸至72℃，时间持续40s，重复循环40 次。上游引物的序列为5’-GCTCCGGTAGGTCACG-3’，下游引物的序列为5’-CCTGGGTCAAGTGTCGGAG-3’。

1.2.3 细胞培养及转染 将结直肠癌细胞株DLD1 培养于含有1%青链霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，放置于5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中进行培养，温度控制在37℃，按照转染试剂盒说明书进行转染，分为转染组、阴性对照组和空白组。

1.2.4 Transwell 实验 （1）迁移实验：取各组转染后培养48 h 细胞，于胰酶消化之后收集细胞，使用无血清的RPMI-1640培养基重悬，配制成为2×105/ml 细胞悬液，取200μL 放置于Transwell 小室上室，将800μl 的含有20%胎牛血清的培养液加入Transwell 小室下室，放置于二氧化碳体积分数为5%的培养箱，温度控制在37℃，时间为24h。将室内液体倾去，再放置于4%多聚甲醛溶液中固定30min，温度为室温，在风干之后取2%结晶紫进行染色，时间为30min，将聚碳脂膜内侧面的细胞擦去，于显微镜下对外侧面细胞进行观察，随机选取5 个高倍镜视野，对穿膜细胞数进行计数，每组各3 个复孔；（2）于低温条件下将无血清培养基调制为1mg/mL 的Matrigel 胶溶液，均匀铺于Transwell 上室，在风干之后以备用。剩余步骤同迁移实验。

1.3 观察指标

（1）比较结直肠癌组和癌旁组miR-411-5p 相对表达量；（2）分析结直肠癌患者临床病理特征与miR-411-5p 相对表达量的关系；（3）比较miR-411-5p 转染组、阴性对照组和空白组对癌细胞侵袭、迁移能力。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0 统计软件对数据进行处理，计量资料应用平均值±标准差（±s）表示，采用t检验和方差分析，计数资料与百分数（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 结直肠癌组和癌旁组miR-411-5p 相对表达量比较

结直肠癌组miR-411-5p 相对表达量为（0.78±0.23），显著低于癌旁组的（1.94±0.27），差异有统计学意义（t=-23.126，P＜0.05）。

2.2 结直肠癌患者临床病理特征与miR-411-5p 相对表达量的关系

miR-411-5p 在结直肠癌组织中的表达与年龄、性别、肿瘤直径以及肿瘤部位无关（P＞0.05），与TNM 分期、淋巴结转移、组织分化程度相关（P＜0.05）。见表1。

表1 结直肠癌患者临床病理特征与miR-411-5p 相对表达量的关系（±s）

表1 结直肠癌患者临床病理特征与miR-411-5p 相对表达量的关系（±s）

项目 例数 miR-411-5p 相对表达量 t 值 P 值性别男29 0.81±0.25 1.027 0.310女21 0.74±0.22年龄（岁）＜60 18 0.82±0.27 1.531 0.132≥60 32 0.72±0.19 TNM 分期Ⅰ期+Ⅱ期 25 0.89±0.28 3.816 0.000Ⅲ期+Ⅳ期 25 0.64±0.17组织分化程度高分化+中分化 36 0.93±0.29 3.791 0.000低分化 14 0.62±0.15肿瘤直径（cm）＜5 22 0.83±0.24 1.152 0.255≥5 28 0.76±0.19淋巴结转移有21 0.59±0.16 -5.919 0.000无29 1.04±0.32肿瘤部位直肠 26 0.75±0.19 -1.513 0.137结肠 24 0.84±0.23

2.3 miR-411-5p 上调对癌细胞迁移和侵袭能力的影响

转染组迁移细胞数和侵袭细胞数均显著低于阴性对照组和空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；阴性对照组和空白组迁移细胞数和侵袭细胞数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 miR-411-5p 上调对癌细胞迁移和侵袭能力的影响（±s，个）

表2 miR-411-5p 上调对癌细胞迁移和侵袭能力的影响（±s，个）

注：与转染组比较，aP ＜0.05。

组别 迁移细胞数 侵袭细胞数转染组 75.28±8.34 84.87±7.14阴性对照组 136.49±26.83a 152.26±29.05a空白组 141.56±28.69a 157.19±31.78a F 值 31.047 46.452 P 值 0.000 0.000

3.讨论

在恶性肿瘤及其发病机制当中，mi-RNA 所起到的作用越来越受到专家学者的重视[4]。近年来，随着相关研究技术的进步以及认识的不断深入，人们对结直肠癌mi-RNA 的研究已经取得了较大的进展，已经发现多种与恶性肿瘤病理过程有密切关系的mi-RNA，如mi-RNA-98、mi-RNA-3960 等[5]。mi-RNA 几乎参与了绝大多数细胞生物学的进程，包括细胞侵袭、转移、增殖、分化、凋亡等。mi-RNA 可通过调控靶基因、激活受体蛋白以及结合功能蛋白等方式影响恶性肿瘤的发生及发展。

研究显示[6-7]，miR-411-5p 在肝癌等恶性肿瘤中呈低表达，且在乳腺癌骨转移早期诊断中具有较高的临床应用价值。本研究结果显示，结直肠癌组miR-411-5p 相对表达量显著低于癌旁组，表明结直肠癌组织中miR-411-5p 相对表达量较低。mi-RNA与恶性肿瘤发生及发展密切相关，本研究结果显示，miR-411-5p在结直肠癌组织中的表达与年龄、性别、肿瘤直径以及肿瘤部位无关，与TNM 分期、淋巴结转移、组织分化程度相关，说明miR-411-5p 可以在一定程度上反映膀胱癌患者TNM 分期、组织分化程度、淋巴结转移，可作为患者病情进展情况评估的重要指标。

临床中，大多数恶性肿瘤患者死亡的主要原因为病灶转移及侵袭，因而了解癌细胞侵袭及转移机制具有重要意义。吴克盛等[8]的研究指出，上调miR-411-5p 表达可以抑制胃癌细胞迁移。本研究中，转染组迁移细胞数和侵袭细胞数均显著低于阴性对照组和空白组，说明特异性上调miR-411-5p 表达可以有效减少结直肠癌细胞侵袭及迁移能力，提示miR-411-5p 可能影响了结直肠癌细胞侵袭及迁移。

综上所述，结直肠癌组织中miR-411-5p 相对表达量较低，与结直肠癌的发生、发展相关，且表达水平上调可以抑制癌细胞的侵袭以及转移。不过由于结直肠癌发生涉及多步骤及多基因，miR-411-5p 在发生及进展中的作用机制需要进一步研究。