党参-茯苓-甘草水提物对学习记忆障碍小鼠的抗氧化及免疫调节功效评价

徐飞飞，王梓林，王洁，李钦青，田雅娟，楚世峰，贺文彬

（1.山西中医药大学中药与食品工程学院，中医脑病学山西省重点实验室，山西太原 030024）

（2.中国医学科学院药物研究所，北京 100050）

学习记忆障碍（Learning and memory impairment）作为机体正常衰老与痴呆之间的过渡阶段，临床表现为信息获取和重现能力的缺失，是评价阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的主要神经症状标准[1]。腹腔注射氢溴酸东莨菪碱是常用的建立学习与记忆能力损伤动物模型的方法，它能够拮抗乙酰胆碱受体影响中枢神经系统的胆碱能功能，还能使海马中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的酶活性降低，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量升高[2-4]。现代医学研究认为，脑氧化损伤是学习记忆障碍等神经系统退行性疾病的病理特征，过量的氧自由基蓄积会导致神经元损伤或死亡，影响大脑的学习与记忆功能，因此减少氧自由基的形成及保护神经元免受自由基影响，是改善学习记忆障碍的一种有效的途径[5-7]。中草药在中医基础理论指导下，具有悠久的用药历史，尤其是“药食同源”中药，作为天然抗氧化剂安全营养，对预防、治疗疾病有显著疗效[8,9]。

党参为多年生草本植物桔梗科党参（Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.）的干燥根，具有健脾补肺，益气养血等功效，其活性成分党参多糖，能够清除自由基改善东莨菪碱诱导的记忆学习障碍[10]；通过增强机体免疫应答水平，参与细胞免疫和体液免疫过程[11]；此外，研究发现党参多糖能够提高机体耐缺氧能力[12,13]。《本草从新》曰：“参须上党者佳”，本实验选用“药食同源”山西道地药材潞党参。茯苓作为“四君八珍”中药之一，《神农本草经》将其列为上品，有利水渗湿、健脾安神等功效，其活性成分茯苓多糖对失眠健忘、免疫力低下等症状均有改善作用[14-16]。蜜炙甘草药性温和，补脾和胃，益气复脉，能够改善脾气虚弱，倦怠乏力，心悸气短等症状[17,18]。研究发现甘草水提取物对阿尔茨海默病有一定的改善作用，其活性成分甘草酸可通过抗炎、抗氧化等药理作用发挥脑保护功效[19,20]。

本研究将党参、茯苓、甘草三味药食两用中药材配伍，通过氢溴酸东莨菪碱诱导的的学习记忆障碍模型，评价不同剂量党参-茯苓-甘草水提物的改善作用。分别检测小鼠海马中SOD、GSH-Px酶活力，及MDA含量；血清中白细胞介素-2（interleukin 2，IL-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；脾脏中自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）活力，探讨水提物改善学习记忆障碍的作用机制。此外，还将党参-茯苓-甘草水提物作用于正常小鼠，评价其抗疲劳功效。

1 材料与方法

1.1 受试动物

SPF级雄性健康昆明（KM）小鼠，体重25±3 g，100只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0006。小鼠于实验前7 d置于实验室适应环境，室温 23±2 ℃，相对湿度50%～60%，12/12 h明暗交替，自由饮食、摄水。本文所做实验均获得伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

潞党参，购自山西省振晋堂中药材发展有限公司，批号：20190603；茯苓、甘草，购自山西元和堂中药有限公司，批号：1907005、190502；盐酸多奈哌齐，购自卫材（中国）药业有限公司，批号：1902038；氢溴酸东莨菪碱，购自湖北佳诺信生物化工有限公司；SOD、GSH-Px、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；IL-2、TNF-α、NK试剂盒，均购自研吉生物（WKSUBIO）有限公司，批号：20191102、20191201、20191206。

Heraeus Multifuge X1R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；R540增强型动物麻醉机，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；VERSA max-BNRO5709酶标仪，上海美谷分子仪器有限公司；XR-XZ301小鼠旷场及分析系统，上海欣软信息科技有限公司；THZ-92B气浴恒温箱，上海博讯实业有限公司；EX125DZH电子分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 党参-茯苓-甘草水提物制备

取潞党参粗粉、茯苓粗粉各100 g，甘草20 g（质量比5:5:1），按照《中国药典》2015年版蜜炙法通则0213方法对甘草进行炮制，制得蜜炙甘草。上述三味中药加10倍量的水浸泡1 h，煎煮1.5 h。过滤，药渣加8倍量水煎煮1 h。过滤，合并两次滤液，常压浓缩至1 mL药液相当于原药材1 g。取10、20、40 mL水煎液加三蒸水，得剂量为10、20、40 g/kg的药液，即党参-茯苓-甘草低、中、高剂量，置于4 ℃冰箱贮存备用。

1.3.2 实验动物分组

100只KM小鼠中选取60只，随机分为6组：正常组，模型组，党参-茯苓-甘草低、中、高剂量组（10、20、40 g/kg），阳性药组，每组10只。正常组、模型组小鼠每日灌胃生理盐水，党参-茯苓-甘草低、中、高剂量灌胃10、20、40 g/kg剂量水提物，阳性药组灌胃盐酸多奈哌齐（1.5 mg/kg），灌胃剂量为 10 mL/kg·d，不间断给药30 d，进行党参-茯苓-甘草水提物对学习记忆障碍小鼠的影响实验。另40只KM小鼠，随机分为4组：空白组，党参-茯苓-甘草低、中、高剂量组，每组10只，进行党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠的影响实验。

1.3.3 党参-茯苓-甘草水提物对学习记忆障碍小鼠的影响

1.3.3.1 对自主活动的影响

小鼠于第30 d灌胃结束30 min后，进行旷场实验。用SuperMaze动物行为学视频分析软件将敞箱平均分为九格，小鼠每穿过一格记为一分，即水平得分；记录在敞箱内站立以及理毛次数总和，一次记一分，即垂直得分。各组小鼠依次置于敞箱内，适应 2 min后记录小鼠在 5 min内的水平得分与垂直得分。用75%乙醇对敞箱进行擦拭，除去上一只小鼠的气味后，将下一只小鼠放入。

1.3.3.2 对新物体识别的影响

新物体识别实验分为适应、熟悉和测试3个阶段。实验第30 d自主活动测试内容即为适应阶段；第31 d，将两个完全相同的木方块（旧物体）放入实验箱内对称的位置处，两物体距离侧箱壁、箱后壁的距离均相等，将小鼠从旷场箱中距物体等距离处放入，让小鼠在试验箱内自由探究10 min，即为熟悉阶段；第32 d，将其中一个木方块换为另一个大小相近颜色为红色的木三角块（新物体），采用 SuperMaze分析软件，分别记录小鼠5 min对木三角块和木方块的探究时间，计算新物体识别指数，即测试阶段。

本阶段每只小鼠在放入敞箱20 min前，正常组小鼠腹腔注射生理盐水，模型组、党参-茯苓-甘草组、阳性药组小鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱（2 mg/kg）造成记忆障碍。实验时需清理小鼠在实验箱内的排泄物，并用75%乙醇擦拭实验箱及识别物体，消除对下一只小鼠实验的影响。

1.3.3.3 对小鼠脑组织抗氧化系统的影响

行为学试验结束后，异氟烷麻醉小鼠，记录体重。眼眶取血后脱颈椎处死，迅速于冰上断头取脑，用生理盐水冲掉血液，取海马、脾脏、胸腺，滤纸擦干后称重，置于-20 ℃保存备用。ELISA试剂盒检测小鼠海马中SOD、GXH-Px、MDA的含量。

1.3.3.4 对小鼠血液细胞因子及脾脏自然杀伤细胞活性的影响

小鼠血液离心（3000 r/min，15 min），取上清液分装备用。ELISA试剂盒分别测定小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量，以及小鼠脾脏中NK细胞活性。

1.3.4 党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠的影响

1.3.4.1 抗疲劳负重游泳实验

小鼠于第30 d灌胃结束30 min后，每只动物尾部负重铅片（体重×0.5 g），置于水箱中（50×50×40 cm），水深约为30 cm，水温25±2 ℃，记录每只动物放进水箱至放弃游泳并下沉的时间。

1.3.4.2 对抗氧化系统及免疫系统的影响

操作同1.3.3.3，计算小鼠海马中SOD、GXH-Px、MDA的含量。采用称重法，计算得出胸腺、脾脏指数，并测定脾脏NK细胞活性。

1.4 数据处理

实验结果均为计量资料，实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 6.02统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），p＜0.05视为具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 党参-茯苓-甘草水提物对学习记忆障碍小鼠的影响

2.1.1 对自主活动的影响

本研究将以新物体识别行为学实验对小鼠学习记忆能力进行评价，需确保各组小鼠的自主活动无显著差别，采用Li等人[21]的方法，对小鼠自主活动指标水平得分与垂直得分进行统计分析。如表1所示，各组小鼠水平得分与垂直得分无显著差异（p＞0.05），表明不同剂量党参-茯苓-甘草水提物对小鼠的自主活动不产生显著影响，可进行新物体识别行为学测试。

表1 党参-茯苓-甘草水提物对小鼠自主活动的影响Table 1 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos- Radix glycyrrhizae water extract on mouse atonomous activities

2.1.2 对新物体识别指数的影响

新物体识别法是用于评价学习记忆能力使用最广泛的行为学测试方法[22-25]。Lueptow等[22]研究发现，相比于Morris水迷宫、被动回避等其他行为学测试，新物体识别测试能够利用啮齿类动物对新异物探索的天性，使其在接近自然条件下做出反应，该测试方法不会对实验对象造成积极或消极刺激，能够避免因应激引起行为变化。

如图1所示，在新物体识别实验中，正常小鼠在对木方块（旧物体）有记忆的情况下，对木三角块（新物体）探索时间增加，所以正常组新物体识别指数大于50%；氢溴酸东莨菪碱建立的记忆障碍模型小鼠，由于对木方块的记忆模糊，视木方块与木三角块均为新物体，并且对二者的探索时间相当，所以其新物体识别指数下降至 50%左右，与正常组相比显著降低（51.12±5.80v.s73.65±7.39，**p＜0.01），说明小鼠对熟悉的旧物体的记忆模糊，学习记忆障碍模型建立成功，趋势与Li等研究相同[21]。水提物处理后，党参-茯苓-甘草低、中、高剂量组均能够显著增加模型鼠的新物体识别指数（62.97±4.45v.s51.12±5.80；64.32±5.21v.s51.12±5.80；69.41±7.12v.s51.12±5.80），均表现出极显著差异（##p＜0.01），以高剂量组（40 g/kg）效果最明显，说明不同剂量党参-茯苓-甘草水提物能够小鼠对记忆障碍起到一定的改善作用。

图1 党参-茯苓-甘草水提物对认知障碍小鼠新物体识别指数的影响Fig.1 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos-Radix glycyrrhizae water extract on novel objects recognition index of learning and memory impairment mice

表2 党参-茯苓-甘草水提物对学习记忆障碍小鼠海马抗氧化系统的影响Table 2 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos-Radix glycyrrhizae water extract on hippocampal antioxidant system of learning and memory impairment mice

2.1.3 对海马内抗氧化系统的影响

有研究表明，脑组织对氧化损伤较敏感，SOD、GSH-Px及MDA是评价氧化应激的重要指标[26]。由表2可知，与正常组相比，模型组小鼠海马中SOD、GSH-Px酶活力分别降低了41%、46%，MDA水平升高了 88.6%，差异极显著（**p＜0.01），说明学习记忆障碍小鼠脑中的氧化系统与抗氧化系统失衡。而经过不同剂量党参-茯苓-甘草水提物处理后，小鼠海马中SOD、GSH-Px酶活力均显著升高，高于模型组（##p＜0.01），MDA 显著降低（#p＜0.05，##p＜0.01），作用效果呈量-效关系，其中高剂量组表现出与阳性药相接近的效果（##p＜0.01）。表明党参-茯苓-甘草水提物可有效提高学习记忆障碍小鼠脑海马组织中SOD、GSH-Px活性，降低过氧化产物MDA以延缓氢溴酸东莨菪碱所致的脑组织氧化应激，其中高剂量抗氧化效果最佳。学习与记忆作为脑的高级功能，是两种相联系且复杂的神经过程，学习记忆功能障碍是多因素诱导的结果[27,28]。Lawrence[29]提出在学习记忆障碍阶段进行适当干预，是防止疾病进一步演化成痴呆的新方法。近年来，中药在治疗疾病的应用中，表现出有效的抗氧化活性及其他广泛的药理作用[30,31]。李启艳等[32]通过党参多糖干预D-半乳糖所致衰老小鼠，发现能够显著提高小鼠血清与肝脏中SOD、GSH-Px酶活性，降低MDA含量；并且研究发现，潞党参中多糖、炔苷含量优于其他产地党参，具有良好的抗氧化活性[33]。在卢华杰等[34]的抗氧化试验研究中，发现茯苓中水溶性多糖与酸性多糖均能够对羟基自由基产生清除作用，且水溶性多糖清除率高于酸性多糖。早在上世纪，Kenzo等[35]发现甘草素清除活性氧能力是维生素E的3倍，甘草提取物在现代食品研究中常作为甜味剂、抗氧化剂等多种食品添加剂被广泛应用[36]，本实验得到的党参-茯苓-甘草水提物具有抗氧化活性结论与上述研究结论相符。

2.1.4 对血清细胞因子的影响

表3 党参-茯苓-甘草水提物对认知障碍小鼠血清细胞因子的影响Table 3 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos-Radix glycyrrhizae water extract on serum cytokines of learning and memory impairment mice

病理条件下，氧化应激能够引起炎性反应，炎性反应也能够诱导氧化应激，二者形成恶循环，加重神经病变[37]。本实验通过检测小鼠血清中IL-2、TNF-α评价党参-茯苓-甘草水提物的免疫调节作用。由表 3可知，若以正常组血清中炎性因子 IL-2、TNF-α为100%，学习记忆障碍模型组小鼠血清中IL-2、TNF-α水平则明显升高到 370.79%、265.36%，差异极显著（**p＜0.01）。经过党参-茯苓-甘草水提物处理后，中、高剂量组小鼠血清中IL-2下降到291.29%、242.60%（##p＜0.01），TNF-α水平均显著降低到 214.57%、175.05%（##p＜0.01）。Petitto 等[38]发现大脑中 IL-2 缺乏与免疫系统之间的复杂相互作用可能会改变大脑学习和记忆过程，认为 IL-2缺乏会导致神经生物学异常。不过，Eleanor等[39]证实轻度认知功能障碍患者外周炎性反应增加，炎性因子IL-2与TNF-α水平升高，认为炎症是造成AD早期病症的主要原因之一，与本研究结果相一致。在病理条件下，炎性趋化因子在协调天然和获得性免疫反应中起关键作用，其引起的炎性反应对机体稳态起着保护性效应，同时过度的炎性反应又能够损伤机体，导致机体稳态失调[40]。此外，相关研究表明，潞党参能够抑制 TNF-αRⅠ、IL-15R基因的表达来降低炎性因子IL-6、TNF-α、IL-15水平[41,42]；茯苓多糖作用于免疫缺陷鼠后也能够调节IL-2、TNF发挥免疫调节活性[43]；蜜炙甘草可促进小鼠T、B淋巴细胞增殖，相比甘草生品更能增加小鼠的免疫功能[44]，结合本实验结果，可以说明党参-茯苓-甘草水提物（20 g/kg、40 g/kg）对学习记忆障碍小鼠具有有效的免疫调节作用。

2.1.5 对脾脏自然杀伤细胞活性的影响

图2 党参-茯苓-甘草水提物对认知障碍小鼠脾脏NK细胞活性的影响Fig.2 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos-Radix glycyrrhizae water extract on activity of spleen NK cells of learning and memory impairment mice

党参-茯苓-甘草水提物对小鼠脾脏 NK细胞活性的影响见图 2。学习记忆障碍模型组小鼠脾脏中 NK细胞活性较正常组显著降低（4022.51±556.35v.s5874.81±233.19，**p＜0.01），党参-茯苓-甘草各剂量组能够提高模型小鼠脾脏中 NK 细胞活性（ 4281.31±593.52v.s4022.51±556.35 ； 4989.67±1278.82v.s4022.51±556.35；6511.32±869.33v.s4022.51±556.35），随着剂量的增加，NK细胞活性也显著增强，且高剂量组差异极显著（##p＜0.01）。细胞因子IL-2、TNF-α对NK细胞的活化和分化有调节作用，NK细胞主要分布于脾脏与外周血，是抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，参与机体免疫调节[45,46]。传统中医理论认为党参、茯苓、炙甘草均具有健脾功效，所以本实验对小鼠脾脏中自然杀伤（NK）细胞活性进行测定，发现高剂量党参-茯苓-甘草水提物（40 g/kg）可有效增强记忆障碍小鼠机体免疫力。一般而言，IL-2、TNF-α能够刺激NK细胞增殖[47]，实验结果“2.1.4”中发现水提物对炎性因子IL-2、TNF-α起到抑制作用，则水提物作用后NK细胞活性应呈现降低趋势，但检测结果却相反，初步认为可能与检测样本的来源不同相关。不过已有相关报道与本实验结果趋势一致，认为党参（提取物）、茯苓（茯苓多糖）、甘草（甘草酸、甘草甜素）均能够促进NK细胞增殖[48-50]。

2.2 党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠的影响

2.2.1 对小鼠负重游泳的影响

运动耐力的下降能直观的反映机体处于疲劳状态，负重游泳是衡量药物及保健食品抗疲劳特性最常选择的评价指标[51,52]。本实验通过记录游泳时间的长短以反映小鼠耐力[12,53,54]，党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠负重游泳时间的影响见图3。结果显示，党参-茯苓-甘草低、中、高剂量组均能够延长正常小鼠游泳时间（97.38±26.14v.s67.88±14.16；118.00±27.11v.s67.88±14.16；128.00±29.66v.s67.88±14.16），且中剂量与高剂量组延长率高达73.84%及88.57%，差异极显著（**p＜0.01）。张天红等[53]发现潞党参提取液能显著延长小鼠运动耐力，并且彭梅等认为党参粗提多糖是通过抑制尿素氮的产生和控制乳酸的含量，从而达到抗疲劳的作用[12]；同样，符辉[54]、楚丽雅[55]等通过运动耐力及生化指标的测定，发现茯苓多糖与甘草水提物也均能够降低尿囊素及乳酸含量，延长小鼠负重游泳时间，本实验结果与他们的结论一致，说明党参-茯苓-甘草水提物具有一定的抗疲劳作用。

图3 党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠负重游泳的影响Fig.3 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos-Radix glycyrrhizae water extract on weight-bearing swimming of normal mice

2.2.2 对小鼠抗氧化系统的影响

同样，我们对党参-茯苓-甘草水提物的抗氧化活性进行了重复验证，判断其是否能够显著调节正常小鼠脑组织的抗氧化系统。如表4所示，与空白组相比，党参-茯苓-甘草高剂量组小鼠海马中SOD酶活力显著升高（**p＜0.01）；党参-茯苓-甘草低、中、高剂量组GSH-Px酶活力显著升高（**p＜0.01），MDA水平显著降低（*p＜0.05，**p＜0.01），高剂量组依然能显著升高SOD、GSH-Px酶活力，增加约正常组指标的一半（48.20%、57.07%），进一步证明党参-茯苓-甘草水提物对小鼠脑海马的抗氧化活性。

表4 党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠海马抗氧化系统的影响Table 4 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos-Radix glycyrrhizae water extract on hippocampal antioxidant system of normal mice

表5 党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠免疫系统的影响Table 5 Effect of Radix codonopsis-Poria cocos-Radix glycyrrhizae water extract on immune system of normal mice

2.2.3 对小鼠免疫系统的影响

本研究采用任颖朗等[56]的方法，通过对胸腺与脾脏指数的分析，以及自然杀伤细胞活性的检测，简单判断党参-茯苓-甘草水提物对细胞免疫与体液免疫的影响。由表 5可知，党参-茯苓-甘草水提物高剂量组能够显著增加正常小鼠胸腺指数与脾脏指数（*p＜0.05）；而且党参-茯苓-甘草低、中、高剂量组能够使小鼠脾脏中NK细胞活性增加32.97%（*p＜0.05）、30.31%（*p＜0.05）与 43.29%（**p＜0.01）。胸腺与脾脏都是机体重要的免疫器官，胸腺能够产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，参与细胞免疫；脾脏中有丰富的B淋巴细胞，与体液免疫密切相关，所以脏器指数在一定程度上能够反映机体免疫功能的强弱[57]。本实验结果说明党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠免疫系统能够起到一定的调节作用。

3 结论

3.1 党参-茯苓-甘草水提物对学习记忆障碍的改善作用实验中，低、中、高剂量党参-茯苓-甘草水提物分别使记忆障碍小鼠的新物体识别指数提高 11.85%、13.2%与18.35%；各剂量水提物能够显著提高海马组织清除自由基酶SOD、GSH-Px活性，降低脂质过氧化产物MDA水平。此外，血清中炎性因子IL-2、TNF-α也显著降低；高剂量党参-茯苓-甘草水提物还能够使学习记忆障碍小鼠脾脏中 NK细胞的活性提高2488.81 U/g。党参-茯苓-甘草水提物能够发挥抗氧化活性，提高记忆障碍小鼠机体的免疫力。

3.2 党参-茯苓-甘草水提物对正常小鼠抗疲劳、免疫调节作用实验中，中剂量与高剂量党参-茯苓-甘草水提物均能够显著延长小鼠的负重游泳时间，比正常鼠分别增加50.12 s、60.12 s；水提物还能够显著提高正常鼠胸腺指数与脾脏指数，及酶SOD、GSH-Px、NK细胞活性；显著降低过氧化产物MDA水平。该结果重复验证了的党参-茯苓-甘草水提物抗氧化活性与免疫调节作用，而且发现水提物能够对正常鼠起到抗疲劳的效果。

3.3 党参-茯苓-甘草水提物能够对学习记忆障碍小鼠起到改善作用，作用机制与抗氧化、免疫调节活性相关，并且党参-茯苓-甘草水提物还具有抗疲劳的作用。这为今后参苓草口服液功能保健食品提供了实验基础，更为“药食同源”中药对疾病的预防、治疗与保健功能提供研究依据，使其在保健食品行业中具有可观的研究与开发前景。