人脐血间质干细胞条件培养基在受损成骨细胞中的作用与机制

蔡梓红 何可人 娄爱菊 叶文斌 叶苗漫 宋李治 黄闯 曾裕威 魏建国* 王簕*

1.广州医科大学，广东 广州 510089 2.广州市荔湾中心医院，广东 广州 510140 3.广州医科大学附属第三医院3D打印中心，广东 广州 510150 4.广州医科大学附属第三医院骨科，广东 广州 510150

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种由多病因引起的破骨细胞和成骨细胞(osteoblast，OB)失衡，以单位体积内骨量减少的代谢性骨疾病，严重影响患者生活质量[1]。目前研究发现，OP患者体内氧化还原反应失衡，机体中AOPP水平越高则单位体积内骨量越低[2]。晚期氧化蛋白(advanced oxidation protein products，AOPPs)作为氧化应激(oxidative stress，OS)的终产物之一，可以促进活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成[3]。因此推测OS可能与OP发生发展有密切联系，AOPPs是OP进展的重要危险因素之一。

新近研究认为，HUMSCs可在组织损伤时分泌外泌体，促进组织再生，调控炎症，抵抗OS作用[4]。单纯移植干细胞由于其在体内存活率较低[5]，不能持续发挥其对OS的调控效应。因此，近来应用干细胞条件培养基进行治疗组织损伤已成为研究热点[6]。

AOPPs可导致OB凋亡，线粒体(mitochondrion)是细胞发挥正常功能，保持活性的重要结构。OS导致的细胞内ROS过量积累，可引发线粒体结构受损,最终导致细胞凋亡[7]。有报道称，干细胞来源的线粒体可以向损伤组织转移，从而起到组织保护作用[8]。因此推测，干细胞可以通过保护线粒体，继而为OB提供保护作用。本研究拟通过AOPPs刺激OB，观察靶细胞内线粒体的活性变化，探讨线粒体在OS中的作用以及HUMSCs培养基是否能为氧化损伤后的OB提供保护作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、噻唑蓝(MTT)、Annexin V-FITC/Propidium lodide(PI)细胞凋亡试剂盒购自sigma公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；DMEM低糖培养基、干细胞培养基购自Gibco公司；Mito Tracker deep Red购自Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3单克隆抗体购买自Santa Cruz公司。

1.2 晚期氧化蛋白的体外制备

将20 mg/mL HSA无毒溶液与40 mmol/L次氯酸(HOCL)同体积混合培养，然后室温下放置30 min，制得HSA与HOCL摩尔浓度比1∶140的AOPP。为了除去游离的HOCL，将上述制得的AOPPs在PBS无内毒素溶液中透析24 h，后用0.22 μmol/L的微孔滤膜过滤除菌后4 ℃保存备用。PBS与20 mg/mL HSA溶液同体积混合作为对照。在酸性条件下，以氯胺T为标准，测定AOPP在340 nm的吸光度值。

1.3 HUMSCs提取和条件培养基的制备

脐带来自广州医科大学附属第三医院妇产科干细胞库，实验室已建立完善的相关细胞培养鉴定方案，并发表相关文章[9]。脐带取材后用PBS反复冲洗，洗净脐动脉、静脉内残留血液。剪碎至约1 cm×1 cm×1 cm组织块，置于无菌培养皿内，加入DMEM培养基直至完全覆盖组织块，1周后换液，观察细胞形态，弃除非贴壁组织块，以后每3 d换液，观察细胞形态。细胞长至80%细胞融合度时，0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。取第2代HUMSCs，按一定比例接种于培养皿中，当达到80%细胞融合度时，更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基(Fetal bovine serum DMEM Medium，FM)，继续孵育48 h以后，收集培养基上清液，离心(4 000 r/min，20 min)，0.22 μmol/L过滤器过滤获得条件培养基(HUMSC Conditioned Medium，CM)，4 ℃保存备用。

1.4 OB的培养与鉴定及实验分组

第2代人成骨细胞由南方医科大学创伤骨科赠予，南方医科大学有完善的成骨细胞检测方法流程，并发表相关文章[10]。实验分为4组，正常对照组(Control组)；AOPP刺激组(AOPP组)：无血清DMEM中加入终浓度为200 μg/mL的AOPP；常规培养基组(AOPP+FM组)：在FM中加入最终浓度为200 μg/mL的AOPPs；条件培养基组(AOPP+CM组)：在CM中加入最终浓度为200 μg/mL的AOPPs。各组作用时间均为1 h。

1.5 OB凋亡检测

收集上述分组细胞，用预冷的PBS液重悬细胞2次，加入适量1x结合缓冲液，轻吹打以重悬细胞，调整细胞浓度为1×109/L，取100 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，室内温度避光孵育15 min，加入5 μL PI轻轻混匀染色。按照Annexin V-FITC/PI双染色法凋亡试剂盒说明书操作，准备好样品后，上流式细胞仪进行凋亡率检测。

1.6 Mito Tracker deep Red标记线OB内线粒体

各组培养皿内滴加同等适量无血清DMEM培养基并覆盖盖玻片进行爬片培养，当细胞长至80%融合度，洗除培养基，加入37 ℃预热的Mito Tracker Red 染色工作液，孵育15 min后使用无菌PBS轻轻洗除表面残余物，染色结束置于荧光显微镜下观察，采用Image J v1.58软件对视野下线粒体红色标记的OB进行半定量计数。

1.7 OB线粒体活性定量检测

按上述分组进行干预，收集细胞，用PBS稀释至105个/mL，采用流式细胞仪进行检测。激发光波长为488 nm，发射光波长为520～545 nm。

1.8 Caspase-3凋亡蛋白表达检测

采用Western-Blot法。取各组细胞，PBS清洗，冰上裂解，离心后取蛋白上清液，用BCA试剂盒以定量检测蛋白浓度，取25 g蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，脱脂牛奶(5%)封闭3 h，室温封闭1 h。加入1∶1000稀释的兔抗人Caspase-3抗体，4 ℃过夜，同1∶2000稀释后二抗反应，室温孵育1 h，ECL显色，暗室曝光观察。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 HUMSCs条件培养基细胞形态

按本研究设立方法提取和培养可获得具有活性的HUMSCs，细胞生长情况良好(图1)，HUMSCs条件培养基获得后(图1)，4 ℃保存备用。实验室已建立完善的相关细胞培养鉴定方法，并发表相关文章，有成骨分化图[11]。

图1 HUMSCs培养与条件培养基收集情况Fig.1 HUMSCs culture and collection of conditioned medium

2.2 各组OB凋亡检测结果

流式细胞仪分析显示，Control组中细胞凋亡率为2.5%，AOPP组为42.5%，AOPP+FM组为32.3%，AOPP+CM组为22.3%。其中，加入CM后，可以明显降低AOPP作用下引起的OB凋亡率，并且AOPP+CM组细胞凋亡率明显低于AOPP+FM组(P<0.05)(图2)。

2.3 Mito Tracker deep Red标记各组OB内活性线粒体实验结果

与对照组相比，给予AOPP刺激后，OB内活性线粒体染色数目明显减少；在此基础上，给予FM和CM后，可以降低AOPP作用，增加OB内活性线粒体染色数目。特别是应用CM后，OB内活性线粒体染色要多于FM作用组(图3)。

2.4 OB内线粒体活性定量分析实验结果

进一步对各种条件干预后OB内活性线粒体定量分析提示，对照组中OB活性线粒体为84.2%，AOPP组为29.5%，AOPP+FM组为64.9%，AOPP+CM组为77.4%。在AOPP+CM组中，OB内活性线粒体染色率明显高于AOPP+FM组(P<0.05)(图4)。

2.5 Caspase-3凋亡蛋白表达检测实验结果

Western-Blot分析不同条件作用下，OB内Caspase-3凋亡蛋白表达水平。可见经过AOPP诱导的氧化损伤后，OB内Caspase-3凋亡蛋白表达水平明显升高，在加入FM或CM后可降低Caspase-3凋亡蛋白表达水平，其中AOPP+CM组下降最明显(P<0.05)(图5)。

图2 各组OB凋亡检测结果A：各组OB细胞凋亡百分比流式细胞图；B：各组OB细胞凋亡百分比柱形图Fig.2 Detection results of OB apoptosis in each group A: The percentage of apoptosis of OB cells in each group with flow cytometry; B: The histogram of the percentage of apoptosis of OB cells in each group注：*表示AOPP+CM组凋亡率要明显低于AOPP+FM组(P<0.05)。

图3 Mito Tracker deep Red 标记线粒体半定量分析结果A：标记各组OB内活性线粒体实验结果，红色为活性线粒体；B：Image J细胞计数半定量分析柱状图Fig.3 The results of semi-quantitative analysis of mitochondria labeled with Mito Tracker deep RedA: The results showed that the active mitochondria in OB were marked in red; B: Histogram of image J cell count semi-quantitative analysis.

图4 OB内线粒体活性定量分析实验结果A：各组OB内线粒体活性定量分析百分比流式细胞图；B：各组OB内线粒体活性定量分析百分比柱形图Fig.4 Experimental results of quantitative analysis of mitochondrial activity in OBA: The percentage flow cytometry was used for quantitative analysis of mitochondrial activity in OB in each group; B: Column chart of quantitative analysis percentage of mitochondrial activity in OB in each group.注：*表示AOPP+CM组活性线粒体含量要明显高于AOPP+FM组(P<0.05)。

图5 Caspase-3凋亡蛋白表达检测实验结果A：Western-blot印迹图；B：Caspase-3凋亡蛋白定量分析百分比柱状图Fig.5 Experimental results of the expression of apoptotic protein Caspase-3 A: Imprint map of Western blotting; B: Caspase-3 Percentage histogram of apoptotic protein with quantitative analysis.注：*表示AOPP+CM组Caspase-3凋亡蛋白表达水平要明显水平低于AOPP+FM组(P<0.05)。

3 讨论

先前研究已经证实，OS是OP发生发展的重要因素之一，其表现主要为骨破坏的增加，影响老年人骨密度[2]。骨组织中ROS会随年龄增长而增多，通过对相关信号通路的调节，影响细胞核内基因的转录表达，引起骨重建过程中OB生成减少，骨细胞凋亡增加，破骨细胞活性增强等，介导OP的发生发展[12]。本研究证实AOPPs可诱导OB凋亡。

那么，如何才能降低AOPPs诱导下OB的凋亡率？近年来，随着对干细胞认识的不断深入，研究发现干细胞具有调节炎症作用，能降低局部OS效应，促进靶细胞功能恢复。Wang等[13]用MSCs与受氧化应激损伤的小鼠胰岛微血管内皮细胞共同培养，发现内皮细胞功能明显改善，其成活率明显提高。本研究也发现，采用HUMSCs条件培养基作用OB后，可以明显降低AOPPs对OB的负性作用，减低OB凋亡率，同时OB凋亡相关蛋白Caspase-3表达也明显降低。Zhu等[14]的研究结果与此类似，这也证明了干细胞能够有效保护OB免受氧化应激损伤。

目前认为线粒体是参与细胞凋亡调节的重要细胞器之一[11]。研究发现，ROS过量会导致线粒体膜电位显著降低，线粒体膜通透性升高，线粒体功能障碍。同时，促凋亡蛋白表达上调，引导内质网应激和Ca2+超载，内源性凋亡通路激活，最终导致细胞凋亡[9]。这与本研究结果一致，即AOPP刺激OB后，可显著降低OB内活性线粒体的数量，引起细胞凋亡。

但是，当将氧化损伤OB置于人体脐带干细胞条件培养基中培养后，OB凋亡明显减低，可能是由于HUMSCs条件培养基中含有大量抗氧化应激相关因子，这些因子可以有效减少线粒体破坏，降低细胞凋亡率。Jiang等[15]用MSCs与角膜上皮细胞共同培养，以鱼藤酮诱导的OS反应，发现MSCs作用下角膜上皮细胞愈合增强，线粒体转移增加，这进一步表明干细胞能通过线粒体功能的活化来修复或保护靶细胞。

综上所述，HUMSCs条件培养基可缓解氧化应激反应导致的线粒体功能与结构损伤，并下调Caspase-3凋亡蛋白的表达，降低OB的凋亡。