蛋白酶工业化生产中产量及质量的影响因素分析

2021-01-19陈思羽

生物化工 2021年4期

陈思羽

（中南林业科技大学，湖南长沙 410000）

酶是一类具有生物催化活性的生物大分子物质，可以分为蛋白质酶和RNA 酶两大类。酶可以在特定条件下催化生化反应，与无酶催化的化学反应相比，具有反应效率高、条件温和等特点，而且酶通常具有很强的专一性，可以催化所需的特定反应，避免副反应发生，大大提高了原料的利用率。因此，酶在许多领域如化工、轻工、纺织、医药、食品等都有广泛的应用。酶工程就是酶的生产、改性和应用的技术过程。

工业中应用的酶主要来源于微生物发酵生产。与动植物源相比，微生物源酶具有来源广泛、易分离、易大规模生产、不受季节、环境、伦理问题影响等诸多优势，微生物发酵产酶是酶工程的基础[1]。在应用酶的工业领域中，蛋白酶的应用最为广泛，蛋白酶商业销售额约占全球酶销售总额的60%。因此，以蛋白酶为例，从菌种选育、酶学性质、产酶条件3 个方面初步分析提高酶产量和质量的方法，为生物酶制剂更广泛的工业化提供思路[2-3]。

1 菌种选育

微生物类群所具有的生物多样性是开发新蛋白酶和新产酶菌株的基础。产酶菌种本身所具有的生理生化性质是影响酶产量和质量的最重要的因素之一。现有常用产蛋白酶菌株包括细菌中的芽孢杆菌属、假单胞菌属、变形杆菌属，霉菌中的曲霉、毛霉，放线菌中的诺卡氏菌和高温放线菌等[4]。其中最主要的是芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等[5]。

自然界中的野生型产酶菌株往往不能达到工业生产及商品化的要求，为了提高工业产酶的产量和质量，通常会利用诱变育种、基因重组、原生质体融合等遗传学技术原理对野生型菌株进行适应性改造。

1.1 诱变育种

按诱变手段可将诱变育种分为物理诱变、化学诱变和生物诱变三大类。常用的物理诱变因素包括紫外线、快中子、X 射线、γ 射线等，化学诱变因素包括碱基类似物如5-BU 和烷化剂等。王金才等[6]通过紫外诱变育得比出发菌株地衣芽孢杆菌HL-3酶活提高34.26%的菌株A2；王茜[7]以枯草芽孢杆菌AS1.398 为出发菌株，以等离子体和钴60 伽马射线处理诱变得到一株高产lCo16 号诱变菌株；马宏宇等[8]以枯草芽孢杆菌Z5 为出发菌株，通过硫酸二乙酯诱变得到一株产新型蛋白酶的突变株Z5-14。

为了得到较好的诱变效果、提高诱变效率，育种工作中也常常采用复合诱变的方法。陈茏[9]以野生型解淀粉芽孢杆菌CL-10 为出发菌株，经紫外和硫酸二乙酯复合诱变育得一株较出发菌株产量提高14.03%的突变株CL-10-1；黄子凌等[10]以枯草芽孢杆菌WT 为出发菌株，经紫外和氯化锂复合诱变得到一株产量提升44.2%的突变菌株UL-191；胡悦等[11]以地衣芽孢杆菌E-417 为出发菌株经氯化锂和等离子体复合诱变育得一株高产突变菌株F-3，产量提高75%。

1.2 基因重组育种

基因重组育种是指利用基因重组相关的原理和技术对微生物细胞进行改造。广义上的基因重组分为3 个层面：个体水平，如生物个体间的杂交；细胞水平，如细胞融合和原生质体融合；分子水平，如DNA杂交。对于微生物的杂交育种，由于其条件苛刻，要求进行杂交的两亲本菌必须具有有性生殖循环或准性生殖循环，且重组频率极低，仅能达到10-7左右，因此应用较为困难，相关报道较少。

1976 年，Fodor 等人[12]和Schaeffer 等人[13]最先发表了关于微生物原生质体融合育种的报道，成功进行了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的种内原生质体融合。该技术打破了遗传物质交流的最大障碍——细胞壁，有望实现跨种、属等的远缘杂交，因而倍受关注，并于20世纪70年代以来发展迅速。韩志双等[14]以产酸性蛋白酶的米曲霉菌株Y-9 和F-5 为出发菌株，通过原生质体融合技术进行基因改组，育得产量较双亲本株分别提高253.37%和276.25%的重组米曲霉G11；朱振华[15]以黑曲霉UV-11 和枯草芽孢杆菌MC7 为双亲本经原生质体融合育得一株能产糖化酶和蛋白酶的融合子4-5#，蛋白酶产量较亲本MC7提高7.8%。

分子层面的基因工程育种理论上是最易控制、成功率最高、真正能突破物种间障碍的实现几乎所有生物间远缘杂交的方法。基因工程的主要步骤是：获得目的基因；制备基因载体；连接目的基因与载体；将连接后的载体转入受体细胞内，完成重组。感受态细胞转化法是最常见的将载体转入的方法，周桂旭等[16]用Spizizen 低盐环境感受态转化法将质粒pBE2R-AP转入枯草芽孢杆菌WB600 中育得可稳定表达碱性蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌；彭文坚等[17]将转录因子Aft1 转入毕赤酵母Pichiapastoris GS115 中，得到SGT 胰蛋白酶较对照菌酶活提升19.71%的重组菌株PP-SGTm/Aft1；李怡欣等[18]将地衣芽孢杆菌subCopt基因与信号肽AmyE 连接，转入枯草芽孢杆菌MA08 中，育得可分泌大量胞外酶且酶活提高73.4%的重组工程菌。

2 酶学性质

在实际应用中，天然酶的特性往往也是限制其规模化使用的因素，大多数天然酶的抗氧化能力较差，热稳定性、耐酸碱能力也往往不能达到工业要求。因此，为了适应工业化的大规模使用，天然结构的酶通常需要用蛋白质工程相关的原理和技术进行改造，通过替换基团、增减残基、连接键等方式提高其抗氧化性、热稳定性、活性等。

Bassem 等[19]鉴定了对短小芽孢杆菌CBS 所产丝氨酸蛋白酶活性具有重要作用的5 个氨基酸残基Leu31、Thr33、Asn99、Phe159 和Gly182，构建了12 个突变体，其中突变体N99Y 热半衰期在50 ℃和60 ℃分别提高了440 min 和215 min，最适温度从65 ℃上升到75 ℃。周桂旭[20]对蛋白酶BAPB92 第188、239 和262 位氨基酸残基进行定点突变，构建的4 个突变体热稳定性相比天然酶均得到提高，其中单一突变188 位和239 位氨基酸和组合突变A188P/V262I 的耐碱性也得到提高。汤恒[21]通过对蛋白酶SES7 进行理性设计得到了底物选择性和热稳定性均有所提高的突变体L2-5。

3 产酶条件的优化

微生物在自然条件下可产多种胞内及胞外酶，但工业生产中其他杂酶往往会增加目标产物的分离难度。不同种类的微生物合成目标酶的代谢模式不同，最适条件也不同，有些酶的合成还受不同物质的诱导或阻遏。而且合成酶的最适条件通常不是该微生物的最适生长条件，因此需要平衡产酶条件与生长条件，使产出最大化。工业生产中通过控制发酵产酶过程的工艺参数可以控制产酶微生物的代谢通路和合成模式，优化产酶条件，从而达到提高酶产量和质量的目的。

耿静等[22]从海水中筛得一株产蛋白酶的中度嗜盐菌Salinivibrio sp. MK070915，以Gibbons 培养基为基本培养基，优化培养条件后，所产蛋白酶活性明显提高。张秀江等[23]对菌株Bacillus subtilis YKM05 进行研究后发现其最适产酶诱导物为羽毛粉，Ca2+和Fe3+对产酶具有促进效果。优化产酶条件后，酶产量最高达到650 U/mL。朱泓等[24]以枯草芽孢杆菌BY25 为材料，经Box-Behnken 响应面实验分析得到该菌最佳的产酶诱导物为豆制品废渣，优化培养条件后产酶活力从304 U/mL 提高至18 000 U/mL。乔传丽等[25]从新疆传统发酵酸奶中分离得到6 株产蛋白酶菌株，其中初始酶产量最高的库德毕赤酵母D1-3经优化产酶条件后酶产量提高了37.98%。