还有“永生”的DNA 链？（4）

朱钦士 （美国南加州大学医学院）

（上接2021 年第6 期第7 页）

2015 年，Sherley 的实验室用类似的方法（BrdU 和免疫荧光染色），比较小鼠毛囊干细胞分裂时2 个“子”细胞中组蛋白H2A 的1 个变种，H2A.Z 的存在情形，发现在保有永生DNA 链的“子”细胞中，H2A.Z 很容易被探测到，但在要分化的细胞中却探测不到。细胞用盐酸处理后，在2个细胞中都能探测到H2A.Z，说明在含永生DNA链的染色体上，H2A.Z 蛋白是暴露的，而在要分化的细胞中是被屏蔽的。这些结果表明，在干细胞不对称分裂形成的2 个“子”细胞中，组蛋白H2A.Z的存在状况是不一样的。

Sherley 的实验室还研究小鼠毛囊干细胞分裂时组蛋白H3 的甲基化状态在“子”细胞中的分布情形。2014 年发表的一篇文章中，他们发现组蛋白H3 第4 位和第27 位的赖氨酸被3 个甲基修饰（分别为H3K4me3 和H3K27me3）的程度在保留干细胞特性的“子”细胞中要高得多，可作为这些干细胞的标志。

2012 年，美国约翰·霍普金斯大学（Johns Hopkins University）Xin Chen 的实验室用不同颜色的荧光蛋白分别标记果蝇雄性生殖干细胞中“辈分”较高的和新合成的组蛋白H3，再观察干细胞不对称分裂后H3 在“子”细胞中的分布情形，发现保留干细胞特性的“子”细胞继承原组蛋白H3，而新合成的H3 组蛋白则进入要进行分化的“子”细胞。不仅如此，原有的组蛋白H3 第3 位的缬氨酸是被磷酸化的（H3T3ph），而新合成的H3 第3 位的缬氨酸没有被磷酸化。

这些结果表明，干细胞在进行不对称分裂时，不仅保留“辈分”大的DNA 链，还继承与其相连的表观遗传修饰。这些修饰不仅能使继承它们的“子”细胞保持干细胞的身份，也为干细胞分裂时染色体的不对称分配提供依据。

8 表观遗传修饰可能是细胞识别DNA年龄的标志

要细胞识别DNA 的年龄，并且以此决定不同年龄的DNA 在“子”细胞中的分配方式，初看起似乎是不可能的事情。以“永生”DNA 链为模板合成的DNA 链携带的信息极为相似，核苷酸序列99.9%以上互补，而且DNA 复制时在新合成链上产生的错误是随机的，细胞不可能提前“知道”，也就无法发展出根据这少量序列的差别选择性地分配DNA 的机制。要更好地理解这个问题，就需要知道细胞分裂时DNA 是如何分配至2 个“子”细胞中的。

在真核生物的细胞分裂时，细胞中的2 个彼此分开的中心粒（centrosome）向对方发出由微管（microtube）组成的细丝，它们的走向类似地球仪上的经线，组成的结构又像一个纺锤，所以又称为“纺锤体”（spindle）。DNA 复制后，生成的2 份相同的DNA 通过它们的“着丝点”（centromere）彼此连接在一起。着丝点本身也是DNA 的一部分，上面结合许多蛋白质分子。着丝点将DNA 分为“短臂”和“长臂”，通过着丝点连接的2 个染色体就像字母X 的形状，也就是人们熟悉的染色体的样子。

在细胞分配染色体时，所有的染色体都运动至纺锤体中部的一个面上。这个面类似于地球的赤道面，所以，被称为赤道面（equatorial plane）。在赤道面上，通过着丝点连在一起的2 份DNA 各自用其着丝点分别与纺锤体2 端的中心粒发出的微管相连。微管收缩，将2 份DNA“拉”向不同的中心粒，这2 份DNA 就彼此分开，在细胞分裂时进入不同细胞的细胞核，此过程称为“有丝分裂”（mitosis）。

如果在有丝分裂过程中分开的只是DNA，细胞是无法分辨2 份DNA 的年龄的，因为它们之间的核苷酸序列几乎完全相同。但DNA 并不是裸露的，而是与组蛋白组成染色质，在细胞分裂时形成染色体。如果与不同年龄DNA 结合的组蛋白修饰状况不同，细胞就可根据这些差别判断DNA 的年龄，不对称分配就变得可能。

模板DNA 和新合成的DNA 就像双胞胎兄弟，穿同样的衣服，彼此之间的差别就极小，几乎无法辨别。但如果在双胞胎兄弟穿的衣服上作出改变，例如，配戴上不同的徽章，就容易区分彼此。组蛋白的修饰，例如，前文谈到的组蛋白的乙酰化、甲基化、和磷酸化，就相当于在衣服上佩戴各种徽章，细胞即可识别它们。

要选择性地分配DNA（染色体），只有染色体之间的差别还不够，纺锤体中的2 个中心粒也需要有区别，这样“辈分”高的DNA 才“知道”与哪个中心粒相连，从而进入特定的“子”细胞。实际的情形也的确如此：细胞分裂时，每个“子”细胞只接收1 个中心粒，在下一次细胞分裂前，这个中心粒进行复制，形成2 个中心粒，所以，2 个中心粒的“辈分”不同，类似于模板DNA 链和新合成DNA 链的“辈分”。这2 个“辈分”不同的中心粒所结合蛋白质（例如，Ninein 和Cenexin）的情形也不同，这样不同的中心粒就可与不同辈分的染色体相互识别，进而通过微管相连，不同年龄的DNA就可有选择性地进入命运不同的“子”细胞。

9 细胞进行对称分裂和不对称分裂的控制机制

在动物体内，细胞的不对称分裂和DNA 的选择性分配只是干细胞特有的功能，一旦成为体细胞的前体细胞，再繁殖分化成为体细胞，这个功能就消失了，细胞改而进行对称分裂。其中一定有控制机制，决定细胞的分裂是否对称。

在胚胎发育过程中，一个受精卵细胞要形成由数量极其庞大的细胞组成的生物体，在开始阶段也是进行对称分裂，以增加干细胞的数量。例如，从受精卵（可看成是全能干细胞）形成囊胚期的内细胞团中，每一个细胞都是胚胎干细胞，在适当的条件下都可发育成为一个完整的生物体，这些内细胞团的细胞也是通过对称分裂形成的。只有身体逐渐发育成熟，在每种组织中形成成体干细胞后，才开始不对称分裂，以补充不断消耗的体细胞。从发育期干细胞的对称分裂转变为不对称分裂，其中也一定有一个转换机制。

而且即使是成体干细胞也不总是进行不对称分裂。不对称分裂只是在需要干细胞补充体细胞时才发生。干细胞除不对称分裂，也进行对称分裂，分裂形成的2 个“子”细胞都是干细胞，以弥补由各种原因引起的干细胞数量的下降。这也一定有一个控制机制。

然而，要研究这个机制很难，细胞进行有丝分裂的过程极为复杂，控制因素非常多。要从中找出启动非对称分裂的因素，目前还是一个难以实现的目标，但是近年的科学研究已提供一些有趣的线索，表明细胞的不对称分裂与以下因素有关。

9.1 DNA 的甲基化 在上一节中，笔者谈到“永生”DNA 链含有较多的羟甲基化的胞嘧啶。2013年，美国加州大学伯克利分校（UC Berkeley）Michael Conboy 的实验室表明，小鼠胚胎干细胞的不对称分裂需要DNA 的甲基化。如果敲除甲基化酶Dnmt3（DNA methyltransferase-3），这些细胞就不再进行不对称分裂。

DNA 的甲基化状况与组蛋白的修饰密切相关，因此，这个结果无法区分细胞在不对称分裂的过程中，依靠的是DNA 的甲基化状况，还是组蛋白的修饰状况。

9.2 蛋白p53 成体干细胞在体外培养时非常难以扩张，因为其总是进行不对称分裂。每个干细胞分裂时只产生一个干细胞，另一个是要进行分化的体细胞的前体细胞。前体细胞繁殖分化，形成大量的体细胞。这样，干细胞的数量并不会随着细胞分裂而不断增加，其浓度反而会随着培养时间延长体细胞的大量形成而不断被稀释，最后丧失干细胞系。

美国波士顿生物医学研究所的James Sherley发现，如果在干细胞中让蛋白p53 恢复表达，干细胞就会进行对称分裂，形成的后代细胞也都是干细胞，这就解决了在体外增殖成体干细胞的问题。

p53 是一种抗肿瘤蛋白，在DNA 被损伤至一定程度时会阻止细胞进行分裂，防止这些细胞繁殖为癌细胞。p53 的一个信号传递链就是抑制磷酸次黄嘌呤脱氢酶（IMPDH）的活性，阻止它将黄嘌呤核苷（xanthosine）代谢掉。因此，在干细胞培养液中直接加入黄嘌呤核苷也能让干细胞从不对称分裂变为对称分裂，达到干细胞增殖的目的。

9.3 蛋白激酶Pim-1 Pim-1 是一个蛋白激酶，能在其他蛋白质分子的丝氨酸和苏氨酸残基的侧链上加上磷酸根。在细胞进行有丝分裂时，Pim-1 位于纺锤体的两极，磷酸化与微管结合的蛋白NuMA，还与若干与有丝分裂有关的蛋白质相互作用，包括与着丝点结合的蛋白HP-1（hetero‐chromatin protein 1）、给有丝分裂提供动力的动力蛋白dynein、动力蛋白激活蛋白dynactin 等，因此，是与DNA 的分配过程有密切关系的酶。2012 年，美国圣迭哥州立大学（San Diego State University）Mark Sussman 的实验室用BrdU 标记DNA 链的方法检测心肌干细胞进行不对称分裂的状况，发现增加Pim-1 的量能使不对称分裂的几率加倍，表明Pim-1 在干细胞保留“永生”DNA 链的过程中起重要作用。

9.4 组蛋白H3 上缬氨酸的磷酸化 2015 年，前面提到过的美国约翰·霍普金斯大学Xin Chen 的实验室还表明，在雄性果蝇的生殖干细胞的分裂中，组蛋白H3 上缬氨酸的磷酸化状态与细胞是否进行不对称分裂有直接关系。在H3 第3 位的缬氨酸被磷酸化时（H3T3ph），干细胞进行不对称分裂，带有H3T3ph 修饰的组蛋白H3 与“辈分”高的DNA 在一起。如果将第3 位的缬氨酸变为不能被磷酸化的丙氨酸（H3T3A），细胞就从不对称分裂变为对称分裂。该结果被发表于《细胞》（Cell）杂志上，是组蛋白的修饰状况与干细胞分裂方式直接相关的证明。

9.5 Wnt 信号链 2011 年，加拿大多伦多大学（University of Toronto）Cindi Morshead 的实验室报道，在进行不对称分裂的小鼠神经干细胞中，Wnt信号传递链的活性被抑制，而在进行对称分裂的神经干细胞中，Wnt 信号传递链活跃。Wnt 是果蝇的翅膀缺失基因wg（wingless）和小鼠致癌基因intl（integration 1）2 个名称的混合，因为在不同动物中发现的这2 个基因实际上是同一个基因，从线虫、果蝇、小鼠到人中都高度保守，在动物胚胎发育和器官形成上起重要作用。在成体动物中，Wnt 信号看来是和保持干细胞增殖的特性（即通过对称分裂增加干细胞的数量）有关，而在干细胞进行不对称分裂时，Wnt 信号链必须被关掉。

9.6 左-右不对称蛋白Lrd 最有趣的是干细胞的不对称分裂居然与决定小鼠内脏左-右不对称的蛋白Lrd（left-right dynein）有关。敲除小鼠的lrd基因，小鼠内脏位置左右不对称（类似人的心脏在左边，肝脏在右边）的情形就被打乱，变成随机的。前面谈到的美国国立癌症研究所的Amar Klar 发现，降低小鼠胚胎干细胞中lrd信使RNA（mRNA）的浓度，干细胞就不再进行不对称分裂，也不再保留永生的DNA。

目前，得到的研究结果还是零星的，彼此之间也没有关系。这就像一张复杂的拼图，只有少数几片，还彼此不相连，然而这些结果已显示，干细胞的不对称分裂和保留“永生”DNA 链的过程是非常复杂的，要了解它还需要大量的研究工作，但目前对机制还认识不足的状况并不影响理解“永生”的DNA 链存在的事实。

“永生”的DNA 链，其实还和“永生”的生殖细胞一脉相承。

10 “永生”的DNA 链和永生的生殖细胞

在干细胞中“永生”的DNA 链出现之前，所有的生物就已发展出永生的生殖细胞。生物的物种要延续，必须要有将生命传给后代的生殖细胞，而且由生殖细胞繁殖出的后代的寿命不会由于繁殖代数的增加而减少，否则物种就会凋亡。现在身体上的每一个细胞，都是几十亿年前那个单细胞“祖宗”连续不断分裂的后代。从此意义上讲，生殖细胞真的是“永生”的。

与此相反，组成生物身体的细胞，即体细胞，都是有寿命的。无论体细胞有多少防御和修复机制，都终将死亡。由体细胞组成的生物体也都有寿命，而且许多体细胞的寿命比生物体总的寿命要短。

但生殖细胞和体细胞含有完全相同的DNA，生殖细胞所含有的基因，体细胞都具有，为什么体细胞必然死亡，而生殖细胞却能永生？答案是：生殖细胞具有与体细胞不同的表观遗传修饰。要更详细地了解这个问题，可参见笔者的另一篇文章《为什么生殖细胞能永生？》，发表于2014 年5 月10 日《科学网》的博客，或《生物学通报》2014 年第5 期中的文章。

干细胞是随着多细胞生物的出现而发展的，它们在身体发育完成后，执行替补体细胞的任务，完成这个任务的过程和由生殖细胞发展出体细胞相似，因此，可看作是生殖细胞在身体各个组织中的延伸或“派出部队”。干细胞和生殖细胞都是分化程度很低的细胞，都有保持其“真身”的任务，而且都是通过表观遗传修饰完成的。

干细胞数量不多，要在替补体细胞的同时保留自己，就要进行不对称分裂，其中的一个“子”细胞要继承其干细胞的身份和任务。因此，在干细胞分裂时，作为干细胞后代的“子”细胞不仅要继承干细胞的DNA，还必需继承维持干细胞特性的表观遗传修饰，而这些表观遗传修饰是和干细胞中年龄较大的DNA 联系在一起的，这就是干细胞分裂时要选择性地保留“爷爷”辈DNA 的主要原因。干细胞在保留原有表观遗传修饰的同时，也就保留与这些表观遗传修饰相连的，DNA 链的“原件”，这样既能保持干细胞的“真身”，又能大幅减少DNA 链通过复制过程导致的序列变化，降低癌细胞发生的可能性。由此，不得不佩服生物的“聪明”，生物演化的创造力也远超出想象。

然而，将干细胞所保留的DNA 链说成是“永生”的，则只有相对的意义。干细胞毕竟不是生殖细胞，而是会随着生物体的死亡而死亡的，里面的DNA 链也就不可能“永生”。干细胞除进行不对称分裂，还会进行对称分裂，对称分裂时DNA 复制造成的错误也会保留在后代的干细胞中。如果含有“原始文件”的干细胞由于某种原因死亡，而继承带有复制错误的DNA 链的干细胞后代存活下，也可导致“原始文件”的毁灭。因此，在本文中，可给“永生”二字加上引号。但若考虑到Cairns 提出“永生DNA 链”的概念时，只限于干细胞，而没有考虑到干细胞还进行对称分裂的情况，就可理解他将干细胞保留的DNA 链称为是“永生”的。因为在干细胞寿命的范围内，被干细胞保留的DNA 链还真的可以是“永生”的。