葡萄酒中生物胺含量分析和控制措施

刘睿，王琳，毕会芳，孙德鹏，车明秀，胡明燕

山东省食品药品检验研究院（济南 250101）

生物胺是由食品微生物的酶促氨基酸脱羧反应产生的，具有生物活性的一类小分子碱性含氮有机化合物。生物胺普遍存在于鱼类及其制品、奶酪、黄酒、葡萄酒等食品中。按照化学结构，可以将生物胺分为脂肪胺（腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、胍丁胺）、芳香胺（2-苯乙胺、酪胺、章鱼胺）和杂环胺（组胺、色胺、5-羟色胺）；而杂环胺又可细分为咪唑胺（组胺）和吲哚胺（色胺和5-羟色胺）；按氨基数量可将生物胺分为单胺、二胺和多胺[1]。微量的生物胺是生物体内正常的活性成分，但当人体摄入过量的生物胺时，就会引起头痛、恶心等食源性生物胺中毒，严重会危及生命。另外，精胺、亚精胺和胍丁胺等生物胺是致癌物亚硝胺的前提物质[1]。

葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，含有一定酒精度的发酵酒。葡萄酒中的生物胺含量与原料的卫生状况、发酵过程中微生物的代谢以及发酵过程的参数等均有关系[2]。由于酒类的主要成分乙醇（以及微量成分乙醛）能够显著增强生物胺的毒性，因此酒类中所允许的生物胺含量应低于其他食品[1]。一些葡萄酒生产国要求葡萄酒中组胺的含量不得超过：德国2 mg/L，比利时5～6 mg/L，瑞士和澳大利亚10 mg/L，法国8 mg/L，荷兰2 mg/L[3]。我国尚未明确葡萄酒中生物胺的限量要求。葡萄酒中生物胺含量的测定主要通过液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法以及最近新开发的传感器技术进行检测[4]。

根据GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》中液相色谱法测定葡萄酒样本中的9种生物胺含量，并对其进行分析研究。同时对葡萄酒中生物胺的产生原因及控制措施进行系统分析，并对葡萄酒生物胺限量的制定及进一步监管提出意见和建议，以促进我国葡萄酒行业绿色健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

不同品牌葡萄酒样本100批次（其中含国产葡萄酒80批次，进口葡萄酒20批次），市售。乙腈、正己烷、乙酸、乙酸铵，均为色谱纯，海阿拉丁；丙酮，色谱纯，天津康科德；乙醚、正丁醇、三氯甲烷、谷氨酸钠、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸，均为分析纯，上海国药；丹磺酰氯，纯度＞99%，上海国药；1, 7-二氨基庚烷，纯度＞98%，Bepure；2-苯乙胺，纯度＞98%，Bepure；亚精胺三盐酸盐，纯度＞97%，Bepure；尸胺，纯度＞98%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；盐酸章鱼胺，纯度＞97%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；精胺四盐酸盐，纯度＞97%，Bepure；组胺二盐酸盐，纯度＞99%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；腐胺二盐酸盐，纯度＞98%，Bepure；色胺，纯度＞99%，Bepure；酪胺盐酸盐，纯度＞98%，Dr. Ehrenstorfer GmbH。

高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔公司；电子天平，梅特勒-托利多公司；离心机，德国Sigma公司；均质机，德国IKA公司；超纯水发生器，美国密理博公司；酸度计，梅特勒-托利多公司；氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司；滤膜针头滤器，0.22 μm。

1.2 试验方法

1.2.1 试验原理

试样用丹磺酰氯衍生，C18色谱组分离，以1, 7-二氨基庚烷为内标，高效液相色谱仪检测，内标法定量。

1.2.2 试剂配制

内标溶液配制：准确称取适量内标标准品，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液溶解后稀释至刻度，混匀，配制成质量浓度为10 mg/mL的内标标准储备溶液，置-20 ℃冰箱储存。吸取上述内标标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，混匀，作为内标标准中间使用液。吸取1.0 mL内标标准中间使用液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，混匀，作为内标使用液。

衍生试剂配制：准确称取适量丹磺酰氯，以丙酮为溶剂配制质量浓度为10 mg/mL的衍生剂使用液，置4 ℃冰箱避光储存。

生物胺标准系列溶液配制：分别吸取1.0 mL各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，混匀，配制成生物胺标准混合使用液（100 mg/L）。分别吸取0.10，0.25，0.50，1.0，1.50，2.50和5.0 mL生物胺标准混合使用溶液（100 mg/L），置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，混匀，使其质量浓度分别为1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0和50.0 mg/L。

1.2.3 试样制备

准确量取1.0 mL样品于15 mL塑料离心管中，依次加入250 μL内标溶液（100 mg/L）、1 mL饱和碳酸氢钠溶液、100 μL氢氧化钠溶液（1 mol/L）、1 mL衍生试剂，涡旋混匀1 min后置于60 ℃恒温水浴锅中衍生15 min，取出，分别加入100 μL谷氨酸钠溶液，振荡混匀，60 ℃恒温反应15 min，取出冷却至室温，于每个离心管中加入1 mL超纯水，涡旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮（约1 mL），加入0.5 g氯化钠涡旋振荡至完全溶解，再加入5 mL乙醚萃取，涡旋振荡2 min，静置分层后，转移上层有机相（乙醚层）于15 mL离心管中，水相（下层）再次用乙醚萃取，合并两次萃取液，40 ℃水浴下氮气吹干。加入1 mL乙腈振荡混匀，使残留物溶解，经0.22 μm滤膜针头滤器过滤，待测定。

1.2.4 色谱条件

色谱柱，Xbridge C18，3.5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相，甲醇（A）-20 mmol/L醋酸铵（B）；检测器，紫外检测器（波长254 nm）；柱温，35 ℃；流速，1.00 mL/min；进样体积，10 μL。

以此色谱条件将标准品和样品色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中各组分的色谱峰。

1.2.5 标准曲线绘制

分别移取1 mL生物胺标准系列溶液，置于10 mL具塞试管中，依次加入250 μL内标使用液（100 mg/L），以下操作同试样的衍生步骤。将20 μL系列混合标准工作液的衍生液分别注入高效液相色谱仪，测得目标化合物的峰面积，以系列混合标准工作液的浓度为横坐标，以目标化合物的峰面积与内标的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 样品测定

将试样的衍生溶液注入高效液相色谱仪中，测得峰面积，以保留时间定性。根据标准曲线得到待测液中各目标化合物的浓度。

根据上述试验步骤，测定葡萄酒试样中9种生物胺含量，每个样品平行测定2次，结果取平均值。

2 生物胺检测结果与分析

2.1 生物胺检测结果

根据GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》，采用高效液相色谱法对100批次葡萄酒样品中的9种生物胺进行了检测，详细结果见表1和表2。

对全部葡萄酒样品生物胺总量及各生物胺组分检出率进行统计，结果见图1。此次研究结果共7批次样品未测出生物胺，检出率为93%。其中检出率超过50%的生物胺组分分别为腐胺（90%）、组胺（73%）、酪胺（68%）和章鱼胺（53%）。对比国产和进口葡萄酒，检出率均在50%以上的生物胺为腐胺、组胺和酪胺，说明这3种生物胺在葡萄酒中存在最普遍。

表1 国产葡萄酒各生物胺组分含量 mg/L

表2 进口葡萄酒各生物胺组分含量 mg/L

图1 国产和进口葡萄酒各生物胺组分检出率比较

对全部葡萄酒样品生物胺总量及各生物胺组分平均检出值进行统计，结果见图2。对比国产和进口葡萄酒生物胺总量及各生物胺组分的平均检出值进行分析，国产葡萄酒的生物胺总量明显高于进口葡萄酒；对于检出率较高的3种生物胺，国产和进口葡萄酒中的含量均较高，且平均检出值国产葡萄酒明显高于进口葡萄酒。

图2 国产和进口葡萄酒各生物胺组分平均检出值比较

GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》中液相色谱法规定了葡萄酒中各生物胺的检出限和定量限。依据国家标准对国产和进口葡萄酒中各生物胺组分检出率进行统计，结果见图3。国家标准检出限和定量限检出率国产葡萄酒整体高于进口葡萄酒。

图3 生物胺组分检出率

2.2 国产葡萄酒与进口葡萄酒生物胺含量对比分析

此次研究采购的葡萄酒样本为中低档葡萄酒，国产葡萄酒以中档葡萄酒为主，进口葡萄酒以较为低端的餐酒为主。对比国产和进口葡萄酒各生物胺检出率、平均检出值、国家标准检出限及定量限检出率进行分析，国产葡萄酒和进口葡萄酒腐胺、组胺和酪胺检出率较高，且国产葡萄酒中各生物胺含量明显高于进口葡萄酒。根据我国生物胺检测国家标准，国产葡萄酒生物胺检出情况要高于进口葡萄酒。

由此可见，我国葡萄酒生物胺含量的控制需进一步改善。

3 控制措施与建议

3.1 葡萄酒中生物胺产生原因及控制措施

葡萄酒中存在多种生物胺，来自葡萄果实和发酵过程。大量研究表明，葡萄果实中存在腐胺、亚精胺、尸胺、组胺等多种生物胺，其中生物胺的种类和含量受品种、产地、年份、气候、土壤、栽培处理及成熟度等影响[6-7]。葡萄酒酿造包括两个阶段：第一阶段为物理化学或物理学阶段，即在酿造红葡萄酒时，葡萄浆果中的固体成分通过浸渍进入葡萄汁，在酿造白葡萄酒时，通过压榨获得葡萄汁；第二阶段为生物学阶段，即酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵（MLF）阶段[8]。

大量研究表明，葡萄酒中的生物胺主要来源于发酵过程，酿造工艺的选择对于保证葡萄酒的安全性很重要。影响生物胺含量的因素主要是前提氨基酸、酿酒微生物，以及发酵过程的控制[7,9-21]。葡萄酒生产过程中生物胺的控制手段主要有：（1）选择品质优良、卫生状况好的葡萄原料；（2）接种无组氨酸脱羧酶活性的菌株进行MLF；（3）MLF结束后立即对乳酸菌进行清除，可采用添加足够的二氧化硫，添加化学抑制剂或进行瞬间高温灭菌等工艺[7,9-21]。

3.2 建议

3.2.1 制定葡萄酒中生物胺限量要求与相应法规

2011年国务院食品安全委员会办公室印发了《关于进一步加强酒类质量安全工作的通知》（食安办[2011]23号），要求加强对白酒、葡萄酒、黄酒等生产加工过程产生的生物胺的风险检测和评估。建议监管部门严格按照国家要求，建立生物胺风险评估体系，并制定葡萄酒中生物胺的限量要求与相应法规。

3.2.2 加大监管力度，并利用快速检测方法提高监管效率

建议相关监督管理部门能够加大对葡萄酒行业的监督管理力度，对葡萄酒中生物胺等知识进行宣贯普及。通过调研、试验、验证等方式增加生物胺的快速检测方法，以提高监管效率。

4 结论

采用GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》标准中规定的高效液相色谱法，依次对80批次国产葡萄酒和20批次进口葡萄酒中的生物胺含量进行了检测与分析。结果表明，国产葡萄酒与进口葡萄酒生物胺含量的控制尚存在着一定的差距，应持续改进我国葡萄酒中生物胺含量的控制手段，在实际生产中选择品质及卫生状况优良的葡萄果实和适当的酿造工艺，可以相应降低葡萄酒中生物胺的产生。建议监督管理部门制定葡萄酒中生物胺限量标准，增进监督管理手段和监管力度，以确保我国葡萄酒行业的健康发展。