多穗柯根皮苷微波辅助提取工艺优化及抗氧化活性评价

王代波，李冰晶，赵景芳，罗丽平，刘国华，徐青

贵州省生物研究所（贵阳 550009）

多穗柯（Lithocarpus polystachyrusRehd）系壳斗科栎属常绿植物[1-2]，富含根皮苷（phiiorizn）[3]。根皮苷为根皮素和葡糖糖结合而成的苷[4]，是自然界很少存在的“少数黄酮”二氢查尔酮苷类（chalcoensglycoside）[5]，主要存在于多穗柯、苹果、梨等植物的组织中[6]，因在嫩叶、茎、根皮中的含量较高而得名[7]。近年研究发现根皮苷具有多种生物活性，如“三降”（降血压[8]、降血糖[9]、降血脂[10]）、“三抗”（抗氧化[11-12]、抗过敏[13]、抗癌变[14]）、抑菌效果[15]、改善记忆力[16]等，因而根皮苷在医药、化妆品、食品等领域具有广阔的应用前景。试验主要对多穗柯根皮苷的3种提取工艺进行比较及对多穗柯根皮苷的抗氧化性进行研究，以期对多穗柯根皮苷的深入开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多穗柯老叶（采自贵州罗甸）、纯水、食品级乙醇、根皮苷对照品（纯度＞98%，批号GT67195，酷尔化学科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

800电动离心机（上海梅香仪器有限公司）；JEA502型中药粉碎机（北京市泰和格润仪器有限公司）；SHIMADZU UV-1750紫外分光光度计；FW135/FW200电子天平（上海谱春计量仪器有限公司）；KQ-800DE微波仪器（昆山市微仪器公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 根皮苷标准曲线绘制

分析天平精确称量根皮苷标准品6.0 mg，甲醇完全溶解定容于50 mL容量瓶中，得0.12 mg/mL根皮苷标准溶液。分别取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL的0.12 mg/mL根皮苷标准溶液用甲醇定容于10 mL容量瓶中。用0.018 mg/mL根皮苷标准溶液进行波长扫描，确定根皮苷最大吸收波长为284 nm。在284 nm处测定吸光度，得根皮苷质量浓度Y（mg/mL）与吸光度X的回归方程：Y=31.02X+0.025 3，R2=0.999 5。

1.3.2 提取工艺

烘箱60 ℃将多穗柯叶片样品烘干，超微粉碎机将多穗柯叶片粉碎得粗粉，粗粉过筛（2号筛，孔径0.710 mm）得细粉样品。准确称取5.0 g多穗柯样品置于250 mL锥形瓶中，加入提取液（体积分数70%乙醇溶液），微波辅助提取多穗柯根皮苷，提取结束后，抽滤取定量提取液，稀释、定容，过膜测定根皮苷吸光度，计算根皮苷得率。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 提取时间对根皮苷提取率的影响

采用70%乙醇为提取液。提取条件设定为提取温度50 ℃、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。提取时间采用10，30，50，70和90 min。提取后284 nm处测定吸光度，计算根皮苷得率，考察提取时间对多穗柯根皮苷提取率的影响。

1.3.3.2 提取温度对根皮苷提取率的影响

采用70%乙醇为提取液。提取条件设定为1.3.3.1取得较优提取时间、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。提取温度采用10，30，50，70和90 ℃。提取后284 nm处测定吸光度，计算根皮苷得率，考察提取温度对多穗柯根皮苷提取率的影响。

1.3.3.3 提取功率对根皮苷提取率的影响

采用70%乙醇为提取液。提取条件设定为1.3.3.1取得较优提取时间、1.3.3.2取得较优提取温度、料液比1∶30（g/mL）。微波提取功率采用100，300，500，700 和900 W。提取后284 nm处测定吸光度，计算根皮苷得率，考察提取功率对多穗柯根皮苷提取率的影响。

1.3.3.4 料液比对根皮苷提取率的影

采用70%乙醇为提取液。提取条件设定为1.3.3.1取得较优提取时间、1.3.3.2取得较优提取温度、1.3.3.3取得较优微波提取功率。采用料液比1∶10，1∶30，1∶50，1∶70和1∶90（g/mL）。提取后284 nm处测定吸光度，计算根皮苷得率，考察料液比对多穗柯根皮苷提取率的影响。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，设计四因素（A提取时间、B提取温度、C提取功率、D料液比）三水平的L9(34)正交试验，计算各组条件的提取率，进行数据分析，得出优化工艺条件。

1.4 根皮苷粗提物抗氧化性试验

照1.3.4所优化的提取条件，制备多穗柯根皮苷粗提液，将粗提液减压浓缩至干，真空冷冻干燥成粉．将多穗柯细粉、根皮苷固体样品和VC配制成0.1 mg/mL水溶液，分别测定自由基的清除能力，平行测定3次．羟自由基（·OH）清除能力按照文献[17]所述方法测定；超氧阴离子（O2-·）清除能力按照文献[18]所述方法测定；1, 1-二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）清除能力按照文献[19]所述方法测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 提取时间对根皮苷提取率的影响

如图1所示，根皮苷提取率随提取时间延长呈现出先增长后降低趋势，提取时间50 min时提取率达到峰值，因此选用提取时间50 min进行后续的单因素试验。

2.1.2 提取温度对根皮苷提取率的影响

提取率在提取温度50 ℃时取得峰值，提取温度＜50 ℃时，温度越高，提取率越高。提取温度＞50 ℃时，温度越高，提取率越低。因此选用提取温度50 ℃进行后续单因素试验。

2.1.3 微波提取功率对根皮苷提取率的影响

如图3所示，根皮苷提取率随提取功率升高而升高，提取功率700 W时取得峰值，提取功率大于700 W时，提取率开始随功率升高而降低，故提取功率700 W时能取得较好提取效果，选用其进行后续单因素试验。

图1 不同时间提取根皮苷得率

图2 不同温度提取根皮苷得率

图3 不同功率提取根皮苷得率

2.1.4 料液比对根皮苷提取率的影响

由图4可知，料液比小于1∶30（g/mL）时，提取率随料液比快速升高。料液比大于1∶30（g/mL）时，提取率随料液比增大缓慢下降，因此，料液比1∶30（g/mL）即可以达到较好的提取效果。

2.2 正交试验结果与分析

根据单因素试验出的最适宜提取条件，进行四因素（A提取时间、B提取温度、C提取功率、D料液比）三水平的L9(34)正交试验，因素水平表如表1所示，重复3次试验取均值，结果如表2所示，4因素极差满足RA＞RB＞RD＞RC，表明以70%乙醇为提取液时，影响多穗柯根皮苷提取得率的因素依次为提取时间、提取温度、料液比、提取功率，且较优提取条件为A2B2C2D2，即以70%乙醇为提取液时，微波辅助提取多穗柯甜茶根皮苷的最佳条件为提取时间50 min、提取温度50 ℃、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。

图4 不同料液比提取根皮苷得率

表1 L9(34)因素水平表

表2 L9(34)正交试验直观分析表

2.3 根皮苷粗提物抗氧化性试验结果与分析

2.3.1 根皮苷粗提物对·OH清除效果

如图5所示，多穗柯粉和VC清除·OH的能力大致相当，根皮苷粗提物清除·OH的能力显著强于穗柯粉和VC，根皮苷经微波辅助提取后，其清除·OH的能力显著增强，且强于VC。

2.3.3 根皮苷粗提物对DPPH·清除效果

如图7所示，根皮苷粗提物和VC清除DPPH·的能力均高于多穗柯粉；VC清除DPPH·能力高于多穗柯粉和根皮苷粗提物。根皮苷经过提取后清除DPPH·能力有所提高，但还不及VC。

图5 多穗柯粉、根皮苷粗提物、VC对·OH清除率

图6 多穗柯粉、根皮苷粗提物、VC对清除率

图7 多穗柯粉、根皮苷粗提物、VC对DPPH·的清除率

3 结论与讨论

采用正交试验优化微波提取多穗柯根皮苷的提取条件，确定优化提取条件为提取时间50 min、提取温度50 ℃、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。此条件下根皮苷提取率为1.392%，各因素对根皮苷提取率的影响大小排序为提取时间＞提取温度＞料液比＞提取功率。经过微波辅助法提取的根皮苷氧化性明显强于多穗柯粉，表现良好抗氧化性。