响应面法优化螺旋藻蛋白部分酶解工艺

陈小杏，刘慧，张少斌*，赵嶝科，辛桥，刘金洲

1. 沈阳农业大学生物科学技术学院（沈阳 110866）；2. 沈阳农业大学土地与环境学院（沈阳 110866）

螺旋藻是一种低等原核生物，属于蓝藻门，蓝藻纲，段殖体目，颤藻科，螺旋藻属[1-2]。螺旋藻营养成分丰富而均衡，含有多种生物活性物质，如藻胆蛋白、螺旋藻多糖、不饱和脂肪酸、β-胡萝卜素、维生素E、各种微量元素等，具有抗氧化、降血压、降血脂、提高机体免疫力、防癌抑癌、延缓衰老等多种生理功能[3-4]。

相比于动物蛋白，植物蛋白不仅来源广泛、成本低廉，而且植物性蛋白食品几乎不含胆固醇，饱和脂肪酸少，对人体健康更有利。然而，植物蛋白相对分子质量较大，同时受到纤维素的影响，不易消化吸收[5]。因此，利用物理、化学以及酶学方法，体外将植物蛋白部分降解为生物肽和氨基酸，不仅可以提高蛋白质的吸收利用率，而且可以去除某些蛋白的免疫原性[6-9]。从螺旋藻中提取螺旋藻蛋白，并将其部分水解制备螺旋藻肽，不仅提高螺旋藻蛋白质吸收利用率，去除螺旋藻藻腥味，提高食品适口性，而且还可以从中分离制备具有特殊生理功能的生物活性肽[10-13]。

目前，酶解螺旋藻使用的原材料基本都是螺旋藻干粉[14-17]，螺旋藻在干燥过程中，部分蛋白质会变性降解。因此，此次试验采用鲜活螺旋藻分离蛋白质，选用5种蛋白酶对螺旋藻蛋白进行水解，确定最优水解条件，为螺旋藻蛋白的综合开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

螺旋藻（钝顶螺旋藻直线突变株，SP-Dz，实验室自养）；各种蛋白酶（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

HH-4恒温水浴锅（常州国华有限公司）；FA2104A电子分析天平（上海新诺仪器设备有限公司）；TGL-16高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发公司）；722型分光光度计（山东高密彩虹分析仪器有限公司）；pH-25酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；FD-1冷冻干燥机（北京德天佑科技发展有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 螺旋藻蛋白的酶解

采用冻融法裂解新鲜螺旋藻[8]，在10 000g下离心15 min，弃去沉淀，得到螺旋藻蛋白提取液。将适量螺旋藻蛋白溶液加入试管，放入水浴锅中，调节水浴锅的温度使其达到适宜的酶解温度，用NaOH或HCl调节到适当的pH，并按照比例加入蛋白酶，进行酶解。在达到酶解时间时，将螺旋藻蛋白酶解溶液放入95 ℃水浴锅中迅速灭酶10 min，冷却后，在10 000g下离心30 min，弃去沉淀，测定上清液的水解度。

1.2.2 水解度的测定方法

参照孙媛媛等[18]的方法。采用凯氏定氮法测定酶解液中的总氮含量，采用甲醛滴定法测定α-氨基氮含量，然后按式（1）计算水解度。

水解度=上清液中α-氨基氮含量/上清液总氮含量×100% （1）

1.2.3 单因素试验方法

1.2.3.1 酶加入量的确定方法

取6个10 mL试管，分别加入1 mL螺旋藻蛋白质提取液，分别加入浓度1%～6%的蛋白酶，酶解3 h，测定酶解产物的水解度。

1.2.3.2 酶解温度的确定方法

分别于6个10 mL试管中加入1 mL螺旋藻蛋白质提取液，依次加入3%的蛋白酶，酶解温度设定范围为35～75 ℃，酶解3 h，测定酶解产物的水解度。

1.2.3.3 酶解时间的确定方法

分别向6个10 mL试管中加入1 mL螺旋藻蛋白质提取液，依次加入3%的蛋白酶，分别酶解1～6 h，测定酶解产物的水解度。

1.2.3.4 pH的确定方法

依次向6个10 mL试管中加入1 mL螺旋藻蛋白质提取液，加入3%的蛋白酶，pH设定范围为5.5～11.0，酶解3 h，测定酶解产物的水解度。

1.2.4 响应面法优化木瓜蛋白酶酶解螺旋藻蛋白工艺

通过Design Expert 7.0软件中Box-Behnken Design（简称BBD）的设计方法[19]，选定酶加入量、酶解温度和酶解时间3个因素，设计3个试验水平，以水解度为响应值，通过响应面分析，进行水解条件的优化。响应面分析因素水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶加入量对螺旋藻蛋白水解的影响

酶加入量是影响酶解效果的基本因素。如图1所示，酶加入量在1%～5%范围内，水解度随着酶加入量的增加而线性增加。但酶加入量增加，不仅可能导致蛋白质水解过度，氨基酸含量增加，生物活性肽含量下降，而且还会导致生产成本增加。在5种蛋白酶中，木瓜蛋白酶水解度最高，风味蛋白酶水解度最低。

图1 酶加入量对水解度的影响

2.1.2 酶解温度对螺旋藻蛋白水解的影响

如图2所示，不同蛋白酶最适作用温度不同，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶最适温度为55 ℃，胰蛋白酶最适温度为50 ℃，中性蛋白酶最适温度为45 ℃，风味蛋白酶最适温度为40 ℃。在酶的最适作用温度条件下，螺旋藻蛋白水解度最大，在5种蛋白酶中，木瓜蛋白酶水解度最高。低于最适温度，水解度随温度增加而增加，高于最适温度，由于酶蛋白变性，水解度随温度增加而下降，这与大多数酶的理化特性相同[20]。

图2 酶解温度对水解度的影响

2.1.3 酶解时间对螺旋藻蛋白水解的影响

如图3所示，在3 h内，5种蛋白酶对螺旋藻蛋白的水解度均呈线性增加；4 h后，水解度增加缓慢，直至停止。其中，木瓜蛋白酶的水解度远高于碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶。

图3 酶解时间对水解度的影响

2.1.4 pH对螺旋藻蛋白水解的影响

如图4所示，不同蛋白酶的最适作用pH不同。木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的最适pH为6.5，中性蛋白酶的最适pH为7.0，胰蛋白酶的最适pH为8.0，碱性蛋白酶的最适pH为10.0。低于最适pH，水解度随pH增加而增加，高于最适pH，水解度随pH增加而下降，这是由于pH会影响酶和底物可解离基团的带电情况，从而影响酶与底物的相互作用，这与大多数酶的理化特性相同[20]。

图4 pH对水解度的影响

从前述单因素试验可以看出，在相同条件下，木瓜蛋白酶水解度最大，风味蛋白酶水解度最小，其他酶的水解度居中。因此，选择木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，并用响应面法优化酶解工艺。

2.2 响应面试验设计与结果

由单因素试验结果可知，木瓜蛋白酶对螺旋藻蛋白溶液酶解3 h后，其水解度增加缓慢，因此固定酶解时间3 h，选择pH、酶加入量和酶解温度3个因素进行响应面优化。在三因素三水平上设计17组试验，并按照设计方案分别进行试验，得出各自的水解度，即响应值，如表2所示。

表2 响应面设计方案与试验结果

2.2.1 回归方程

将试验中各响应值输入软件，通过Design Expert 7.0软件中ANOVA对试验进行方差分析，结果如表3所示。软件对各个因素水平进行拟合，得到二次响应面回归方程：

2.2.2 方差分析

从表3可以看出，一次项A（pH）和B（酶加入量）对解离度的线性效应极显著，C（温度）对解离度的线性效应显著。由F值大小可以看出，最适pH对螺旋藻蛋白溶液的水解度影响最大，其次是酶加入量，酶解温度的影响最小。二次项A2，B2和C2对解离度的线性效应均为极显著。两因素的交互影响中，AB不显著，AC显著，BC极显著，说明A，B，C三项之间有交互作用，且相互影响非常复杂。同时，模型的F=37.92，p值极显著，相关系数R2=0.979 9，表明模型的预测值与真实值之间有很高的相关性，校正相关系数为0.954 1，表示试验所建立的模型可以解释95.41%的响应值的变化，信噪比为17.245，变异系数为2.09%，表明该模型可信度高，误差很小，能很好反映各因素与水解度的关系，可以用该模型预测螺旋藻蛋白的水解度。

表3 响应面方差分析

2.2.3 响应面分析

通过Design Expert 7.0软件Model Graphs得到响应曲面三维图。固定酶解温度55 ℃，由图5可知pH的影响更大。固定酶加入量4%，由图6可知pH的影响更大。固定pH 6.5，由图7可知酶加入量的影响更大。综合上述结果，当某一因素确定为特定水平后，另外2个因素与水解度响应值之间均呈二次曲面关系，3个因素在各自的水平变化内均呈抛物线，随着某一因素的增加，水解度增加，但达到一定值后，就会随着其增加而减小，每一曲面中，水解度均有一最大值。

图5 pH与酶加入量交互作用响应面三维图

图6 pH与酶解温度交互作用响应面三维图

图7 酶解温度与酶加入量交互作用响应面三维图

2.2.4 相应因素水平的最优化

利用Design Expert 7.0软件，通过Optimization下的Numerical对响应面模型进行数据的最优化处理，得到模型的优化工艺条件为A=6.40，B=4.22，C=54.99，Y=26.846 1，即当最适pH为6.40，酶加入量为4.22%，酶解温度为54.99 ℃时，预测的水解度值最高，达到26.846 1%。为了在实际操作中更为简便，实际试验在pH 6.5、酶加入量4%、酶解温度55 ℃条件下进行测定，其水解度为26.678 0%，与理论预测值十分接近，说明该模型所建立的二次回归方程与实际情况拟合度高，可靠性良好，可以将其作为模型来预测水解度与最适pH、酶加入量和酶解温度之间的关系。

3 结论

以水解度作为检测螺旋藻蛋白质酶解程度的指标，通过单因素试验，确定木瓜蛋白酶的水解度最高；碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解效果类似，居中；风味蛋白酶的水解度最差。选取对螺旋藻蛋白溶液水解效果最好的木瓜蛋白酶做多因素试验，通过响应面分析，得到木瓜蛋白酶的最适反应条件，实际操作条件为：pH 6.5，酶加入量4%，酶解温度55 ℃。此时水解度为26.678 0%，与模型预测值26.846 1%非常接近，预测模型可靠性高，可为螺旋藻蛋白质水解的相关研究以及实际生产等工作提供理论依据。