miR-324-5p靶向调控CARD9对急性胰腺炎腺泡细胞增殖、凋亡的影响及机制

杨陈 曹小瑶 刘明宗 高榕茂

(四川省医学科学院·四川省人民医院(东院)ICU，四川 成都 610101)

急性胰腺炎(AP)是临床常见疾病且病死率极高，根据疾病严重程度分为轻度、中度及重度，其中重度AP患者预后较差且常伴随多种并发症导致患者死亡率升高〔1〕。胰腺腺泡细胞凋亡是AP发生及发展的重要因素，从防止胰腺腺泡细胞凋亡及促进细胞增殖的角度进行干预及治疗成为研究热点〔2〕。微小RNA(miRNA)异常表达可通过调控靶基因表达进而参与AP发生及发展过程〔3〕。研究表明，miR-324-5p在重度AP患者外周血中低表达，同时在缺氧/复氧心肌细胞损伤过程中miR-324-5p下调表达并可抑制心肌细胞凋亡〔4,5〕。然而关于miR-324-5p在AP腺泡细胞增殖及凋亡过程中的可能作用机制研究未见报道。通过靶基因网站预测到胱天蛋白酶募集域蛋白(CARD)9可能是miR-324-5p的靶基因，研究显示早期AP患者外周血CARD9蛋白和mRNA表达显著升高，且CARD9的表达水平与胰腺炎严重程度呈正相关〔6,7〕。但miR-324-5p和CARD9对AP腺泡细胞增殖、凋亡的影响，且miR-324-5p是否通过调控CARD9表达影响AP腺泡细胞增殖、凋亡目前还尚未可知。本研究通过雨蛙肽素处理大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J，观察miR-324-5p表达变化对AR42J细胞增殖及凋亡的影响，验证其与CARD9的靶向作用关系进而为提高临床AP治疗效果提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 胰腺腺泡细胞株AR42J购自美国American Type Culture Collection公司。雨蛙肽购自美国Sigma-Aldrich公司。CARD9 siRNA、si-NC均购自美国GeneCopopia公司；CARD9过表达慢病毒及其对照病毒均购自Polybrene Hanbio公司；miR-NC、miR-324-5p mimic、anti-miR-NC、miR-324-5p抑制剂(anti-miR-324-5p)均购自上海吉玛基因公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基、青霉素-链霉素混合溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)均购自美国Gibco公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海普盛生物公司；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒、Trizol 试剂盒均购自美国Invitrogen 公司；Lipofectamine2000转染试剂、反转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒均购自美国ABI公司；荧光素酶报告基因载体购自美国Invitrogen 公司；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自美国Sigma公司；RNA提取试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；兔抗鼠活化的酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗体、B 细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2，Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgGⅡ抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；RIPA细胞裂解液购自上海生物工程股份有限公司；兔抗鼠CARD9、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27抗体均购自美国CST公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京威格拉斯生物技术有限公司。

1.2细胞培养及AP细胞模型构建 将AR42J细胞培养于含有10% FBS及青霉素-链霉素混合溶液的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2的恒温培养箱内培养。构建AP模型〔8〕：造模前1 d，取AR42J细胞接种于6孔板(5.5×104个细胞/孔)，加入RPMI1640培养基1 ml/孔，放入恒温培养箱内培养，加入浓度为100 nmol/L的雨蛙肽刺激细胞6 h，振荡混匀后继续培养12 h，收集上清液采用ELISA检测TNF-α、IL-6浓度。

1.3细胞转染及分组 未经雨蛙肽作用的AR42J细胞为对照组，雨蛙肽刺激的AR42J细胞为雨蛙肽组。转染前1 d将雨蛙肽刺激的AR42J细胞接种于6孔板(5.5×105个细胞/孔)，随机分为雨蛙肽+miR-NC组、雨蛙肽+miR-324-5p组、雨蛙肽+si-NC组、雨蛙肽+si-CARD9组、雨蛙肽+miR-324-5p+pcDNA组、雨蛙肽+ miR-324-5p+pcDNA-CARD9组。转染时分别用不含FBS的RPMI1640培养基稀释Lipofectamine2000转染试剂、miR-NC、miR-324-5p mimic、si-NC、si-CARD9、pcDNA、pcDNA-CARD9，稀释至浓度为100 nmol/L，参照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行操作，转染6 h后更换为RPMI1640完全培养基，置于恒温培养箱继续培养48 h，收集细胞进行后续实验。

1.4qRT-PCR检测细胞中miR-324-5p及CARD9 mRNA表达水平 收集各组AR42J细胞，PBS洗涤，分别加入Trizol试剂提取细胞总RNA，RNA定量后反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，20 μl反应体系分别为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，上下游引物各0.5 μl/孔，ddH2O 8 μl/孔。qRT-PCR扩增条件为循环1次(95℃ 6 min)，95℃变性15 s循环40次，60℃退火60 s循环40次。miR-324-5p以U6为内参基因，CARD9以GAPDH为内参基因，反应结束后得到各孔样品Ct值，采用2-ΔΔCt算法计算miR-324-5p、CARD9 mRNA相对表达量。

1.5Western印迹检测CARD9、CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、酶切caspase-3蛋白表达 收集各组AR42J细胞，预冷PBS洗涤细胞，分别加入RIPA细胞裂解液，提取蛋白，蛋白样品定量后加入1倍蛋白电泳缓冲液，以50 μg/孔蛋白样本加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)槽内，SDS-PAGE反应条件为80 V 30 min，120 V 90 min，电泳结束后应用半干法将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入含有5%脱脂牛奶中封闭2 h，加入各蛋白一抗(1∶1 000)，4℃条件下孵育24 h，用TBST洗涤3次，15 min/次，置于二抗(1∶2 000)中反应2 h，TBST洗涤后加入增强型化学发光试剂(ECL)进行显色反应，置于凝胶电泳成像仪进行扫描，各蛋白均以GAPDH为内参基因，应用Quantity One软件分析各蛋白相对表达量。

1.6MTT检测细胞增殖 收集各组转染后24 h、48 h、72 h 的AR42J细胞，胰酶消化后接种至96孔板，每孔分别加入质量浓度为5 mg/ml的MTT试剂20 μl，培养2 h后弃上清，每孔分别加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min后应用酶标仪检测490 nm波长处的各孔吸光度(OD)值。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡 收集对数生长期AR42J细胞，利用Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒进行染色，避光条件下依次分别加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl PI，振荡混匀10 min，上流式细胞仪检测各组AR42J细胞凋亡情况，细胞凋亡率=(早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)/细胞总数×100%。

1.8双荧光素酶报告基因实验 分别构建含有野生型CARD9 3′UTR序列的荧光素酶报告基因质粒WT-CARD9与含有突变型CARD9 3′UTR序列的荧光素酶报告基因质粒MUT-CARD9，收集未经雨蛙肽处理的对数生长期AR42J细胞，用含有10%FBS及双抗的RPMI1640培养基稀释AR42J细胞，调整细胞密度为2×105/ml，接种于24孔细胞培养板，分别将WT-CARD9、MUT-CARD9质粒与miR-324-5p mimic或阴性对照共转染至AR42J细胞，每组均设置3次重复，置于恒温培养箱内继续培养48 h，应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测各组细胞相对荧光素酶活性。

1.9统计学处理 应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1对照组与雨蛙肽组TNF-α、IL-6水平比较 对照组TNF-α、IL-6浓度(123.15±11.32)ng/L、(102.14±16.57)ng/L，雨蛙肽组为(316.23±16.47)ng/L、(358.42±18.36)ng/L，雨蛙肽刺激后AR42J细胞TNF-α、IL-6浓度均显著升高(P<0.05)，提示造模成功。

2.2miR-324-5p和CARD9在胰腺炎腺泡细胞AR42J中的表达 雨蛙肽组胰腺炎腺泡细胞AR42J中miR-324-5p表达水平显著低于对照组(P<0.05)，而CARD9 mRNA及蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)。见图1，表1。

2.3miR-324-5p过表达对胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖的影响 qRT-PCR检测结果显示，转染miR-324-5p mimic的AR42J细胞miR-324-5p表达显著上调(P<0.05)，提示成功提高雨蛙肽诱导的AR42J细胞中miR-324-5p的表达水平。MTT检测细胞增殖情况，结果发现雨蛙肽可降低AR42J细胞增殖活性(P<0.05)，而转染miR-324-5p mimic后可增强AR42J细胞增殖活性(P<0.05)。Western印迹结果显示，雨蛙肽处理后CyclinD1蛋白表达显著下调(P<0.05)，而p21、p27蛋白表达显著上调(P<0.05)，miR-324-5p 过表达后CyclinD1蛋白表达显著上调(P<0.05)，而p21、p27蛋白表达显著下调(P<0.05)，见图2，表2。

图1 CARD9蛋白表达

表1 miR-324-5p和CARD9在胰腺炎腺泡细胞AR42J中的表达

图2 增殖相关蛋白表达

表2 miR-324-5p过表达对胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖的影响

2.4miR-324-5p过表达对胰腺炎腺泡细胞AR42J凋亡的影响 雨蛙肽组AR42J细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)，而miR-324-5p过表达后AR42J细胞凋亡率较雨蛙肽+miR-NC组明显降低(P<0.05)。Western印迹结果显示，与对照组比较，雨蛙肽组AR42J细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax、酶切caspase-3表达水平显著升高(P<0.05)；与雨蛙肽+si-NC组比较，雨蛙肽+si-CARD9组Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.05)，而Bax、酶切caspase-3蛋白表达显著下调(P<0.05)。见图3，表3，图4。

图3 细胞凋亡流式图

表3 miR-324-5p过表达对胰腺炎腺泡细胞AR42J凋亡的影响

图4 凋亡相关蛋白表达

2.5抑制CARD9表达对胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖和凋亡的影响 Western印迹实验结果显示雨蛙肽+si-CARD9组AR42J细胞中CARD9蛋白表达水平显著低于雨蛙肽+si-NC组(P<0.05)，提示成功抑制胰腺炎腺泡细胞AR42J中CARD9的高表达。MTT与流式细胞仪结果显示，与雨蛙肽+si-NC组比较，雨蛙肽+si-CARD9组AR42J 48、72 h细胞增殖活性明显升高(P<0.05)，而细胞凋亡率明显减少(P<0.05)，同时Western印迹检测结果显示雨蛙肽组p21、 Bax蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水均显著降低于对照组(P<0.05)；雨蛙肽+si-CARD9组AR42J细胞CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水显著高于雨蛙肽+si-NC组(P<0.05)，而p21、 Bax蛋白表达水显著低于雨蛙肽+si-NC组(P<0.05)，见图5、表4。

图5 CARD9和增殖、凋亡相关蛋白表达

表4 抑制CARD9表达对胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖和凋亡的影响

2.6miR-324-5p靶向调控CARD9的表达 双荧光素酶活性检测结果显示，CARD9的3′UTR中含有与miR-324-59互补的核苷酸序列(图6)；与转染miR-NC比较，共转染miR-324-5p mimic与WT-CARD9野生质粒可使细胞荧光素酶活性明显降低(P<0.05)；而共转染miR-324-5p mimic与MUT-CARD9突变型质粒后细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。抑制miR-324-5p表达后CARD蛋白表达水平(0.81±0.08)显著高于anti-miR-NC组(0.42±0.05)(P<0.05)，miR-324-5p过表达后CARD蛋白表达水平(0.18±0.03)显著低于miR-NC组(0.45±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。

2.7CARD9过表达逆转了miR-324-5p过表达对雨蛙肽诱导的胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖和凋亡的作用 Western印迹检测结果显示，雨蛙肽+ miR-324-5p+pcDNA-CARD9组AR42J细胞CARD9蛋白表达相较于雨蛙肽+miR-324-5p+pcDNA组明显升高(P<0.05)。进一步研究发现共转染miR-324-5p mimic与pcDNA-CARD9后AR42J 48、72 h细胞增殖活性显著降低，而细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而p21、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见表6、图8。

图6 CARD9的3′UTR中含有与miR-324-5p互补的核苷酸序列

1～4：miR-NC组,miR-324-5p组,anti-miR-NC组,anti-miR-324-5p组图7 miR-324-5p靶向调控CARD9的表达

表5 双荧光素酶报告实验

表6 CARD9过表达逆转了miR-324-5p过表达对雨蛙肽诱导的胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖和凋亡的作用

1～4：miR-NC组,miR-324-5p组,miR-324-5p+pcDNA组,miR-324-5p+pcDNA-CARD9组图8 CARD9和增殖、凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

AP发病迅速且疾病进展较快，目前尚无治疗AP的有效方法，研究显示AP发生及发展过程涉及多基因或多条信号通路调控，胰腺腺泡细胞增殖及凋亡与AP疾病严重程度密切相关，而AP发生及发展与miRNAs异常表达有关，其根本原因在于miRNAs异常表达可促使胰腺组织发生炎症反应发生进而参与疾病进展过程〔9,10〕。因此着重分析miRNAs与胰腺腺泡细胞增殖及凋亡的作用关系具有重要意义。

miR-324-5p在肝细胞癌组织及细胞中均呈低表达并可发挥抑癌作用，研究表明上调miR-324-5p表达可降低肝癌细胞增殖迁移及侵袭能力，沉默miR-324-5p表达可促进肝癌细胞迁移及侵袭〔11〕。研究表明miR-324-5p可在多种恶性肿瘤中均发挥抑癌基因作用，并可为癌症的精准治疗提供潜在靶点〔12〕。Rider等〔13〕研究表明miR-324-5p在肺炎患者中呈低表达，并可作为临床诊断肺炎的标志物。但miR-324-5p在AP疾病发生及发展中的作用尚不清楚。本研究结果说明miR-324-5p表达水平降低可能是AP发生的原因之一。通过将miR-324-5p mimic转染至AR42J细胞以此上调miR-324-5p表达，结果发现miR-324-5p过表达后AR42J细胞增殖活性显著增强，CyclinD1蛋白表达水平明显升高，而p21、p27蛋白表达水平明显降低，CyclinD1可通过与CDK4/6结合而调控细胞周期进而促使细胞进入S期，p21、p27又可抑制CyclinD1与CDK4/6结合进而诱导细胞停滞于G1期〔14〕。提示上调miR-324-5p表达可降低p21、p27表达水平促进CyclinD1与CDK4/6结合并促进细胞进入S期促进细胞增殖。同时本研究发现上调miR-324-5p表达后可缓解雨蛙肽素诱导的细胞凋亡情况，即miR-324-5p过表达可抑制胰腺炎腺泡细胞AR42J凋亡，检测线粒体途径相关蛋白表达。Bcl-2蛋白表达水平升高可通过抑制线粒体凋亡途径活化进行抑制细胞凋亡，Bax蛋白表达水平升高可通过促使Cyt-C穿过线粒体膜而激活线粒体凋亡途径进而激活酶切caspase-3蛋白导致细胞凋亡〔15,16〕。提示miR-324-5p过表达可降低雨蛙肽素诱导的AR42J细胞凋亡水平，抑制凋亡因子。

CARD9属于CARD蛋白家族成员，研究表明CARD9可通过调节细胞内信号转导途径进而参与感染性疾病等发生及发展过程〔17〕。研究表明AP发展过程中涉及单核-巨噬细胞激活，CARD9在巨噬细胞中高表达并可通过与Bcl-10结合进而激活下游转录因子-核因子(NF-κB)等信号通路，而NF-κB信号通路激活可加重AP疾病严重程度〔18,19〕。许宏敏〔20〕研究表明老年AP患者单核细胞中CARD9表达水平升高并可通过激活NF-κB信号通路进而形成炎症因子。沉默CARD9可抑制NF-κB和P38MAPKs途径进而减轻大鼠重症AP，CARD9过表达可加重AP疾病严重程度〔21,22〕。本研究结果说明CARD9表达水平升高可能是诱发AP的主要原因。进一步研究发现抑制CARD9表达后可提高胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖活性，降低AR42J细胞凋亡率。本研究采用双荧光素酶报告基因实验验证CARD9是miR-324-5p的靶基因，上调miR-324-5p表达可抑制CARD9表达，同时为明确miR-324-5p是否通过靶向CARD9而影响AR42J细胞增殖及凋亡能力，通过转染miR-324-5p mimic与pcDNA-CARD9共转染至雨蛙肽诱导的AR42J细胞中，结果说明上调miR-324-5p可通过抑制CARD9表达进而促进AR42J细胞增殖，降低雨蛙肽诱导的AR42J细胞凋亡率，其可能是通过上调CyclinD1、Bcl-2蛋白表达及下调p21、 Bax蛋白表达实现的。提示miR-324-5p过表达可抑制靶基因CARD9表达进而促进胰腺炎腺泡细胞增殖，抑制细胞凋亡。

综上，miR-324-5p与CARD9存在靶向关系，miR-324-5p可通过靶向调控CARD9表达促进胰腺炎腺泡细胞增殖并抑制细胞凋亡。但关于miR-324-5p是否同时靶向其他下游靶基因及其可能作用信号通路均有待进一步研究。