原发性肝癌中CD133和EpCAM蛋白表达与阿帕替尼疗效的关系研究

常 健，陈仁旺，杨盛力，胡建莉

华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心，湖北 武汉 430022

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。2010年中国肿瘤注册数据显示，我国肝癌发病率和病死率均跃居全球第一，发病例数约占全球55%，死亡人数占50%，在与肿瘤相关的死亡中仅次于肺癌，居第二位[1]。对于原发性肝癌，手术仍是首选的治疗方式，但多数患者发现时已失去手术机会。对于晚期肝癌患者，全身治疗(包括化疗、靶向治疗)、经肝动脉栓塞化学治疗(transarterial chemoembolization，TACE)、射频消融(radiofrequency ablation，RFA)及中医药治疗等手段可提高患者的生存率，对改善患者生活质量有一定帮助，但远期疗效仍有待提高[2]。

目前索拉非尼是晚期肝癌患者有效的治疗手段，但索拉菲尼只能将晚期肝癌患者的中位生存时间延长3个月。而且价格昂贵，无法从大量的患者中挑选有效人群，限制了其在临床上的使用[3]。随着抗血管生成药物的发展，作用于血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGFR)信号通路的抗肿瘤药物越来越受到广泛关注。其中甲磺酸阿帕替尼(商品名：艾坦)是一种新型口服小分子抗血管生成制剂，可高度选择性结合并抑制VEGFR-2，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。虽然目前尚未批准该药用于除晚期胃癌以外的其他恶性肿瘤的治疗，但已在多种实体瘤中开展了临床研究[4-5]。

Reya等提出肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)理论，肿瘤组织中有少量细胞具有不确定的自我更新、多向分化潜能及产生异质性肿瘤细胞的能力[6]，CSCs的存在是肿瘤复发、转移、放化疗抵抗的重要原因。越来越多的证据表明，肝癌组织中存在一小部分具有CSCs特性的癌细胞，即肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSCs)。近年来LCSCs特异性标志物的鉴定和针对靶向治疗的靶点是研究的热点。目前已经鉴定了几种LCSCs标志物，包括白细胞分化抗原133(CD133)、CD90、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、CD13、CD47和角蛋白19等[7-11]。

本研究分析甲磺酸阿帕替尼一线治疗晚期原发性肝癌患者的无进展生存期(PFS)及肝癌组织干细胞表型特征，并分析可能影响预后的因素，试图探索一种晚期原发性肝癌一线治疗的新的、有明确适应人群的治疗手段，造福广大晚期原发性肝癌患者。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集收集华中科技大学同济医学院附属协和医院2015年2月至2017年8月经病理确诊为Child-Pugh A级的晚期肝细胞癌(HCC)患者33例，均使用一线单药甲磺酸阿帕替尼治疗，未联合其他抗肿瘤治疗。剂量为250～500 mg/d，餐后半小时口服，连续服用，直至出现不可耐受的不良反应或疾病进展。

1.2 免疫组化方法33例肝癌组织标本经常规石蜡包埋，4 μm厚度切片。抗体分别是抗人CD133(目录号：ab216323)、CD90(目录号：ab133350)和EpCAM(目录号：ab223582)小鼠单克隆抗体，均购自Abcam公司。阳性判断参考已发表的文献[12-13]。根据具有阳性细胞质/膜染色的肿瘤细胞的比例，对CD133表达水平进行半定量评分，0分(阴性)：<1%的肿瘤细胞染色；1分：弱染色比例≥1%；2分：中度染色比例≥1%；3分：强染色比例≥1%。染色得分2分和3分被定义为阳性染色，而0分和1分被视为阴性染色[12]。

1.3 随访及疗效评价随访截止时间为2018年3月。用药后根据患者用药前后的影像学资料，按照mRECIST标准评定其疗效。

1.4 统计学处理采用SPSS 26.0软件进行统计学处理，数据以中位数(范围)或绝对频率(%)表示。计数资料的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床生化资料33例患者中，男31例，女2例，男女比例为15.5∶1.0。发病年龄27～76岁，平均年龄50.4岁。患者基本临床特征见表1。33例患者肿瘤组织中CD133、CD90和EpCAM的阳性表达例数分别为16例、17例和17例(见图1)。

表1 33例肝癌患者临床特征Tab 1 Clinical characteristics of 33 patients with liver cancer

图1 肝癌组织中CD133和EpCMA阳性表达的免疫组化结果(SABC，200×) A： CD133阳性表达； B： EpCMA阳性表达Fig 1 Immunohistochemical results of positive expression of CD133 and EpCMA in liver cancer tissues (SABC，200×) A： CD133 positive expression； B： EpCMA positive expression

2.2 分组及相关预后指标将33例患者分为PFS≤3个月组(11例)和PFS>3个月组(22例)，分别与肝癌组织中CD133、CD90和EpCAM的阴性和阳性表达的相关性采用Pearson相关性检验，结果显示，CD133和EpCAM的阳性表达与PFS长短呈负相关(见表2)。

表2 与PFS相关的预测标志物分析Tab 2 Analysis of predictive markers related to PFS

对33例病例进行生存分析，PFS为(2.8±0.3)个月(95%CI：2.24～3.33)。分别以肝癌组织中CD133、CD90和EpCAM的阴性和阳性表达分组进行生存分析，生存曲线显示，CD133阴性组PFS(3.5±0.4)个月高于阳性组(2.1±0.3)个月(P<0.05)。生存曲线显示，EpCAM阴性组PFS(3.5±0.3)个月高于阳性组(2.0±0.3)个月(P<0.05)。生存曲线显示，CD90阴性组PFS与CD90阳性组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图2)。提示：肿瘤组织CD133、EpCAM的阴性和阳性表达均可影响患者生存率，对HCC评估预后具有重要的指导价值。

图2 Kaplan-Meier法分析一线使用甲磺酸阿帕替尼的晚期肝癌患者肝癌组织中CD133、EpCAM、CD90的表达与预后的关系Fig 2 Kaplan-Meier plots for analysis of the relationship between the expressions of CD133, EpCAM, and CD90 in liver cancer tissues and prognosis in patients with advanced liver cancer who used Apatinib mesylate in the first line

肝癌组织中CD133和EpCAM的表达可用于预测甲磺酸阿帕替尼的疗效。图3所示3例患者，分别是CD133、CD90和EpCAM均阴性，CD133阳性，CD133、EpCAM均阳性，甲磺酸阿帕替尼治疗3个月后的疗效分别是疾病进展(PD)、疾病稳定(SD)和部分缓解(PR)。

注：病例1：CD133、CD90、EpCAM均为阴性；病例2：CD133阳性、CD90和EpCAM阴性；病例3：CD133、EpCAM阳性，CD90阴性。

3 讨论

近年来，肝癌的治疗已经有了很大的进展，但晚期HCC患者的总体预后仍较差，如果仅给予最佳支持治疗，欧美患者的的平均生存时间为6～9个月，而亚洲患者(除日本外)的生存期仅为3～4个月[14-17]。两项大型、随机对照的国际多中心临床试验SHAPR和Oriental研究结果表明，索拉菲尼能够延长晚期HCC患者生存时间，因此索拉非尼已获批得180多个国家和地区药监部门的批准，用于无法手术或远处转移的晚期HCC患者，但由于索拉非尼总体客观有效率低，生存获益有限、毒副作用较多、价格昂贵且无有效的疗效预测因子，极大地限制了临床上的广泛应用，因此，对于晚期HCC患者亟需寻找新的有效治疗药物[18]。

肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的关键环节之一，肿瘤组织需依赖新生血管提供的氧气和营养物质来满足肿瘤细胞不断扩增的需要，因此对于肿瘤血管的干预能够有效地抑制肿瘤的生长[19]。甲磺酸阿帕替尼可高度选择性地结合并抑制VEGFR-2，抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长[20-24]。但目前应用的包括索拉菲尼在内的肝癌靶向治疗药物尚无有效的疗效预测指标。肝癌干细胞的生物学特征的许多方面已经被揭示。然而，其生物学作用和机制仍有待阐明，基于肿瘤干细胞的肝癌诊断和根除肿瘤干细胞的治疗均需进一步研究。肝癌细胞具有多种生物标志物的异质性癌细胞，但治疗一般是根据临床分期选择的，因此希望能通过各种标志物的组合对患者进行详细分类，以便提供最佳治疗方案。因此，本研究通过回顾性分析近两年我院肿瘤中心应用甲磺酸阿帕替尼治疗晚期一线原发性肝癌的患者资料，寻找到能够预测其治疗疗效的肿瘤干细胞分子标志物，为医师在临床上选择合适的患者用药提供指导，避免无效治疗和无谓的经济损失。

目前报道的索拉菲尼治疗晚期原发性肝癌的PFS为3～4个月，本研究的结果显示，甲磺阿帕替尼联合最佳支持治疗一线治疗晚期原发性肝癌的PFS达到(2.8±0.3)个月。进一步分析肝癌组织CD133和EpCAM的阴性阳性表达均可影响患者的疾病进展时间，对HCC评估预后具有重要的指导价值。

本研究将33例取得肝癌组织标本的患者分为PFS≤3个月组和PFS>3个月组，分别与肝癌组织中几个分子标志物的表达水平进行相关性检验，结果提示肝癌组织CD133和EpCAM的阳性表达与PFS长短呈负相关。提示以上因素可能与甲磺酸阿帕替尼治疗晚期肝癌疗效相关，可以为临床用药选择提供指导。有研究发现，肝癌组织中CD133和EpCAM的表达可能与肿瘤的侵袭、转移和耐药性相关，这与本研究的结果相符合[23-24]。因此肝癌组织中CD133和EpCAM的表达水平可用于靶向药物选择相关的特定靶点治疗和预测标记。在临床上采用免疫组化这种简单、廉价、可靠的分析方法检测这两种蛋白的表达，从而为临床选择用药提供指导非常有现实意义。本研究为回顾性的、病例数较少，而且治疗方式之间存在交叉，同时部分病例随访时间较短，需要进一步随访后分析。

综上分析，甲磺阿帕替尼在晚期原发性肝癌患者中具有一定临床疗效，是晚期原发性肝癌患者的一种治疗选择，有一定的疗效预测因素。但目前相关临床研究仍较少，其疗效及其预测指标仍需更大规模的临床研究。期待有更多的数据加以证实。