miR-383靶向PRDX3对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭的影响

田 姗，江 海，刘 慧，曹 霞，张 丹，牟尚东，李 曾

1.西安交通大学医学院附属三二〇一医院肿瘤内科，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学生物科学与工程学院；3.西安交通大学医学院附属三二〇一医院血液内科

肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，在全国范围内发病率及死亡率均呈逐渐上升趋势[1-2]。虽然目前对肝癌的诊治技术在不断改进和完善，但其恶性程度高，术后5年生存率仅50%左右[3]，主要原因是患者确诊时多为中晚期，失去最佳手术机会[4]。因此，探寻肝癌新型生物治疗靶标已成为临床研究热点。有研究发现，利用微小载体携带外源RNA进入癌变部位，能够对癌细胞中相关蛋白合成发挥抑制作用，进一步起到抗癌作用[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码单链RNA，存在于真核生物细胞内，能与靶基因mRNA3′非编码区特异性结合，调节基因转录和表达，在细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等过程中发挥重要作用[6]。Yan等[7]研究发现，miR-383可直接靶向PAX6抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭。有研究报道，miR-383在食管鳞癌[8]、卵巢癌[9]中均发挥抑癌作用，但其在肝癌中的生物学功能及作用机制却鲜有报道。人过氧化物还原酶-3(human peroxide reductase-3，PRDX3)是硫氧还蛋白过氧化物酶抗氧化剂家族的线粒体成员，是调节细胞氧化还原状态的线粒体过氧化物还原酶，与肿瘤形成有关[10]。Liu等[11]研究发现，PRDX3促进肝癌的生长并介导细胞增殖、迁移及侵袭，是肝癌潜在治疗靶点。王晓玫等[12]研究发现，在人髓母细胞瘤D341细胞系miR-383过表达可靶向调控PRDX3基因表达水平，抑制D341细胞增殖、侵袭及迁移。因此本研究通过检测miR-383在人肝癌HepG2细胞中表达水平，探讨其与PRDX3靶向关系及对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭的影响，以期揭示miR-383在肝癌发生、发展中作用，为寻找有效生物学靶标、实现肝癌的精准治疗提供一定理论参考。现将具体结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞HepG2肝癌细胞(货号：SCS-519)购自中国科学院上海生物科学研究所。

1.2 主要试剂与仪器DMEM培养基(批号:NBG1236)购自美国Hyclone公司；胎牛血清(批号:36G5782)购自美国Gibco公司；链霉素(批号:NBG1236)、青霉素(批号:FH673J)、二甲基亚砜(批号:N6582J)购自美国Sigma公司；蛋白提取试剂盒(批号:ME861R)、BCA试剂盒(批号:2763DB)、胰蛋白酶(批号:BD735N)购自上海碧云天公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号:YBP165)购自北京百奥莱博科技有限公司；PRDX3(批号:YBS903)、Ki-67(批号:RM-9106)、MMP-2(批号:35G5642)、MMP-9(批号:J1620032)、β-actin(批号:D648JF)抗体、山羊抗兔HRP(批号:674GN6)二抗购自美国Proteintech公司；6孔细胞板(批号:SU732)购自美国Bio-Rad公司；反转录试剂盒(批号:7856GU)购自美国Sigma公司)；AceQqPCR SYBR Green Mix(批号:NC9343)购自南京Vazyme生物公司；Trizol Reagent核酸分离试剂(批号:83H296)购自日本Takara公司；LipofectamineTM3000转染试剂盒(批号:HUDY03)购自美国Invitrogen公司；miR-383 mimic、miR-383 mimic-negativecontrol由上海生工公司合成。CO2培养箱(型号:NHD DYE1738)购自日本Sanyo公司；普通光学显微镜(型号:BNJD7836)购自美国Olympus公司；Elx800酶标仪(型号:HSG9832)购自美国Thermo公司；荧光定量PCR仪(型号:HDBC0291)购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养：复苏HepG2细胞，培养于含质量浓度为150 g/L灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的DMEM培养基中，防止细菌污染，培养于37 ℃饱和湿度、体积分数为5%的CO2、20%的O2培养箱中，每2～3 d更换1次培养液，无菌操作，待细胞生长良好，且达对数生长期时进行后续实验。

1.3.2 细胞转染及分组：将培养至对数生长期的HepG2细胞，用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化，接种6孔细胞板(1×106个/孔)，待细胞融合度至80%时，更换为无血清DMEM培养基，采用LipofectamineTM3000进行转染，严格按照试剂盒说明书进行操作，转染后用无血清DMEM培养基继续培养24 h。实验分为3组：(1)空白(normal glucose，NG)组：只含HepG2细胞；(2)miR-383阴性对照(negative control，NC)组：转染终浓度为100 nmol/L miR-383 NC序列；(3)miR-383过表达(miR-383 mimics)组：转染终浓度为100 nmol/L miR-383 mimics序列。6 h后弃去培养基，更换为质量浓度为100 g/L胎牛血清DMEM培养基培养。转染48 h后将培养板置于倒置荧光显微镜下观察，镜下随机选择3个视野，分别计数细胞总数及绿色荧光的细胞数，计算转染效率，当转染效率为80%时，加入嘌呤霉素进行压力筛选，获得稳定转染细胞株。

1.3.3 实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测miR-383水平：按照试剂盒说明书提取各组HepG2细胞中总RNA，使用分光光度计测定RNA浓度，OD260/280值为1.8～2.0，代表提取的RNA合格；以RNA为模板，按照试剂盒说明书进行逆转录反应，所得cDNA进行qRT-PCR反应。反应体系20 μl：2×ULtraSYBR mixture 10.0 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，上下游引物各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl；反应条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40个循环。引物由大连宝生生物工程有限公司设计并合成，以U6作为内参基因。采用2-ΔΔCt方法计算各组HepG2细胞中miR-383相对表达量。引物设计见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence

1.3.4 MTT法检测HepG2细胞增殖能力：取1.3.2各组稳定表达miR-383的HepG2细胞，将细胞接种于96孔板进行培养，细胞密度为5×104个/孔，分别培养0、24、48、72、96 h后向各孔加入浓度为5 g/L的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后，弃去上清，加入150 μl DMSO，振荡10 min，使蓝紫色结晶充分溶解。在酶标仪中570 nm处测定各孔OD值，重复3次，取平均值。计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(空白组OD值-实验组OD值)/空白组OD值×100%。

1.3.5 Transwell法检测各组HepG2细胞侵袭能力：Transwell小室上室底膜表面铺Matrigel胶(20 μl 2.0 mg/ml)，室温孵育40 min，收集1.3.2转染后的HepG2细胞，采用不含胎牛血清的DMEM培养基调整HepG2细胞浓度(2×105个/ml)，然后在Transwell小室的上室加入100 μl细胞悬液，在下室加入质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养基(600 μl)，放入培养箱继续培养24 h，取出小室，弃上室培养液，采用无水甲醇固定，30 min后擦去上室未透过膜的细胞，结晶紫(0.2%)染色20 min，将其置于倒置显微镜下观察计数。每组实验重复3次。

1.3.6 Transwell法检测各组HepG2细胞迁移能力：取1.3.2转染后的HepG2细胞，采用不含胎牛血清的DMEM培养基调整HepG2细胞浓度(2×105个/ml)，然后在Transwell小室的上室加入100 μl细胞悬液，在下室加入含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养基(600 μl)，放入培养箱继续培养24 h，取出小室，弃上室培养液，采用无水甲醇固定，30 min后擦去上室未透过膜的细胞，结晶紫(0.2%)染色20 min，将其置于倒置显微镜下观察计数。每组实验重复3次。

1.3.7 双荧光素酶报告基因检测miR-383对PRDX3的转录调控：(1)荧光素酶报告基因实验突变型载体的制备：TargetScan数据库显示人PRDX3基因3′UTR区域含2个miR-383结合位点。对含2个位点的PRDX3-3′UTR区域进行扩增，连到PGEM-T载体上，测序筛选，酶切连至pGL4荧光素酶报告载体，构建p-GL3-PRDX3-3′UTR质粒，以此质粒为模板进行定点缺失(Del1：374～380位点；Del2：809～815位点)突变，测序确认突变成功，构建p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del2、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1，2质粒。(2)荧光素酶报告基因实验：HepG2细胞铺48孔板，24 h后，将p-GL4-PRDX3-3′UTR野生型与miR-383 NC共转染，将p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del2、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1，2质粒分别与miR-383 mimics共转染，每组设6个复孔。转染后24 h，收集细胞，加入100 ml荧光素酶检测试剂Ⅱ，测定荧光强度，记作A，之后加入Stop & Glo，测定荧光强度，记作B，采用A/B表示荧光素酶相对活性。

1.3.8 蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达：收集各组HepG2细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，并采用BCA法检测PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9总蛋白浓度，分别取20 μg蛋白上样于SDS-PAGE分离蛋白，将各蛋白转至PVDF膜，放入脱脂奶粉(5%)溶液室温封闭2 h，加入PRDX3(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗体作为一抗，4 ℃孵育过夜，TBST清洗，加入HRP标记山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，采用ECL发光试剂显影，采用Tanon 600图像分析系统拍照，以β-actin为内参分析PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 各组转染效果检测结果倒置荧光显微镜下观察NC组、miR-383 mimics组细胞转染效果，miR-383 mimics组镜下可见绿色荧光，HepG2细胞成功转染miR-383(见图1)。miR-383 mimics组HepG2细胞中miR-383表达水平(1.42±0.23)显著高于NG组(0.87±0.19)、NC组(0.88±0.19)(P<0.05)。

图1 倒置显微镜下观察细胞转染效果(100×)A:NC组；B:miR-383 mimics组

2.2 miR-383过表达对HepG2细胞增殖能力影响随着培养时间的延长，miR-383 mimics组HepG2细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05)，不同时间点miR-383 mimics组HepG2细胞增殖抑制率均显著高于NG组、NC组(P<0.05)(见表2)。

表2 miR-383过表达对HepG2细胞增殖能力的影响Tab 2 Effect of miR-383 overexpression on proliferation of HepG2 cells

2.3 miR-383过表达对HepG2细胞迁移能力的影响

与NG组、NC组比较，miR-383过表达组HepG2细胞迁移数明显减少(P<0.05)(见图2、表3)。

2.4 miR-383过表达对HepG2细胞侵袭能力的影响

与NG组、NC组比较，miR-383过表达组细胞侵袭数明显减少(P<0.05)(见图2、表3)。

图2 miR-383过表达对HepG2细胞迁移、侵袭能力的影响Fig 2 Effects of miR-383 overexpression on migration and invasion of HepG2 cells

表3 miR-383过表达对HepG2细胞迁移、侵袭能力的影响Tab 3 Effects of miR-383 overexpression on migration and invasion of HepG2 cells

2.5 miR-383靶向调控PRDX3基因的关系验证Targetscan(http://www.targetscan.org/)预测结果显示，PRDX3基因3′UTR区有2个miR-383结合位点，分别位于miR-383 3′UTR374-380和809～815。荧光素酶报告基因实验结果见图3，与PRDX3-3′UTR+NC组比较，PRDX3-3′UTR+mimics组的荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；mimics各突变型PRDX3组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与PRDX3-3′UTR+NC组比较，aP<0.05；Del1：374～380位点突变；Del2：809～815位点突变。图3 荧光素酶报告基因实验检测miR-145与MY06基因3′UTR区域的结合Fig 3 Luciferase reporter gene assay was used to detect the binding of miR-145 with 3′UTR region of MY06 gene

2.6 miR-383过表达对HepG2细胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响与NG组、NC组比较，miR-383 mimics组HepG2细胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)(见图4、表4)。

图4 miR-383过表达对HepG2细胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

表4 miR-383过表达对HepG2细胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

3 讨论

肝癌作为一种恶性肿瘤，其发病隐匿，早期症状不明显，多数患者确诊时已是肿瘤转移或晚期，因此具有高发病率、高死亡率特点。目前仍缺乏有效的早期筛查和诊断肝癌的生物学指标。

成熟miRNA是长度为20～23个核苷酸的单链RNA分子，是基因表达的重要调节剂，通常会降低mRNA稳定性，包括介导肿瘤发生过程基因的mRNA。miRNA靶向主要是通过miRNA 5′端(“种子”区域)与mRNA编码区和非翻译区(UTR)内位点之间特定碱基配对相互作用实现的[13-14]。Cui等[15]研究发现，在结肠癌中，miR-383的上调可能通过靶向APRIL的调节来抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Ma等[16]研究发现，miR-383通过靶向调节EPAS1而抑制肺癌细胞增殖、侵袭及迁移，miR-383可能作为治疗肺癌的潜在生物学靶标。以上研究结果说明，miR-383在恶性肿瘤发生、发展中多作为抑癌基因发挥作用。然而，有关miR-383在肝癌发生、发展中的作用及机制研究较少。本研究结果发现，miR-383过表达后肝癌HepG2细胞增殖抑制率明显升高，细胞迁移、侵袭能力均显著下降，提示miR-383过表达可显著抑制HepG2细胞增殖、迁移、侵袭。

本研究采用TargetScan数据库对miR-383靶基因预测发现，PRDX3是miR-383潜在靶基因。PRDX3是PRXS家族重要成员，其定位于线粒体中并由核基因进行编码，可靶向线粒体的氨基酸序列，在内质网合成后经线粒体定位信号转运发挥作用，能够维持线粒体内氧化还原反应动态平衡及肿瘤形成[17-18]。研究表明，PRDX3促进肝癌的生长并介导细胞迁移和侵袭，是肝癌治疗的潜在治疗靶点。Shi等[19]研究发现，肝癌患者的血清PRDX3表达显著高于肝硬化患者及健康对照组，且血清PRDX3表达高的肝癌患者的中位生存时间比PRDX3表达低的肝癌患者的中位生存时间短，可作为非侵入性生物标志物用于肝癌的诊断或预后。王少增等[20]研究发现，PRDX3在人髓母细胞瘤组织及Daoy细胞系中过表达，而miR-383可能通过下调PRDX3的表达水平来抑制Daoy细胞系的增殖，并促进其凋亡。本研究发现，miR-383可显著抑制野生型PRDX3组荧光素酶活性，PRDX3基因3′UTR区与miR-383任一结合位点发生突变均可以恢复荧光素酶活性，提示miR-383可靶向调控PRDX3基因。进一步研究显示，miR-383过表达可显著抑制肝癌HepG2细胞中PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达，表明在HepG2细胞细胞中，miR-383过表达可显著抑制PRDX3基因转录和翻译，并可能通过抑制增殖、侵袭、迁移相关蛋白进而抑制细胞增殖、侵袭、迁移。

综上所述，miR-383在肝癌HepG2细胞中呈低表达，其可能通过下调PRDX3表达抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力，表明miR-383可能作为潜在靶标为肝癌基因治疗提供新方法。本研究存在不足之处，关于肝癌中miR-383靶向PRDX3具体调控过程，需深入研究并进行验证。