乳腺癌癌组织中新肿瘤相关基因LAPTM4B 的表达水平及临床意义

罗云杰，成守金

（1.焦作煤业（集团）有限责任公司中央医院核医学科；2 焦作煤业（集团）有限责任公司中央医院检验科，河南 焦作454000）

据流行病学研究显示，2015 年我国新发的392.39 万例恶性肿瘤病例中, 新发乳腺癌占30.8万例，其发病率居女性恶性肿瘤疾病首位[1]。现有研究证实，乳腺癌发生发展涉及多种癌基因、抑癌基因、非编码DNA 等的调控，随着分子生物学技术的不断发展,寻找乳腺癌相关分子诊断标志物及靶向治疗成为临床研究热点[2-4]。溶酶体相关4 次跨膜蛋白B(lysosome-associated protein transmembrane-4 beta,LAPTM4B)是新近发现的具癌基因特性的新肿瘤相关基因[5]，在胶质瘤[6]、前列腺癌[7]等多种恶性肿瘤疾病中存在过度表达现象， 参与肿瘤发生、 发展及浸润转移。临床也不乏LAPTM4B与乳腺癌的关系类报道，如Rusz 等[8]雌激素受体(estrogen receptor,ER) 阴性的乳腺癌患者癌组织LAPTM4B 基因拷贝数与蒽环类化疗不良反应具正相关关系。鉴于此，本研究拟着重分析乳腺癌癌组织中新肿瘤相关基因LAPTM4B 的表达水平及临床意义，以期为LAPTM4B 在乳腺癌中深入应用提供参考，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集 2019 年 1 月-2020 年 3 月在本院接受乳腺癌手术治疗的患者乳腺癌组织病理标本87 例，每例标本均留存有癌组织及癌旁组织，其中癌旁组织为距离癌组织5cm 处的形态学正常的乳腺组织。纳入标准：⑴经乳腺癌组织病理学确诊乳腺癌；⑵留存有乳腺癌癌组织及癌旁组织（距癌组织5cm 以上的癌旁组织）标本；⑶临床资料及病历资料能满足研究需要。排除标准：⑴组织标本采集前接受过乳腺癌相关放疗、化疗、内分泌治疗或靶向治疗。

1.2 方法 材料与试剂盒：乳腺癌癌组织标本均来源于本院手术切除的乳腺癌及癌旁正常组织，-80℃冻存的新鲜标本；Trizol 试剂盒（Takara 公司）；NanoDrop One 超微量紫外分光光度计 （上海鲸舟基因科技有限公司）；逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)试剂盒（普洛麦格北京生物技术有限公司）；LAPTM4B 引物序列（上海桑尼有限公司合成)。

LAPTM4B mRNA：乳腺癌癌组织标本均来源于本院手术切除的乳腺癌及癌旁正常组织，-80℃冻存的新鲜标本。研磨组织后经氯仿抽提，10%乙酸铵及无水乙醇沉淀后溶于TE，4℃保存，DNA 则于-20℃长期保存；参照 Trizol 试剂盒说明书提取R NA, 紫外分光光度计测定A260、A280 并计算其含量，逆转录调整 RNA 至终浓度 20μg/μl；而后参照逆转录试剂盒说明书进行cDNA 逆转录合成，RNA模板 2μg，PCR 反应体系：2.0μg 10×缓冲液、0.5μl dNTP、 上游引物及下游引物各 0.5μl、0.5μlDNA Taq 酶切、15μl ddH2O 及 1μl 模板。PCR 反应条件：95℃预变性 15min、95℃30s、58℃45s、72℃60s，共计 28 个循环，72℃延伸 10min； 以 β-actin 为内参， 扩增产物经1.2%琼脂糖凝聚电泳后可在电泳条带中出现 241bp、318bp 两条 DNA 片段；2-△△Ct法计算LAPTM4B mRNA 水平。LAPTM4B 上游引物：5'-GGTGGTTTAAAGTATTGTAATTGA-3'； 下游：5'-AACCTTCCTTCTTTCATCTAAC-3'。

1.3 统计学方法 SPSS21.0 软件进行统计分析，计量资料行正态分布其方差齐性检验， 不符合正态分布则采用中位数（四分位数间距）描述，非参数秩和检验；计数资料采用例（%）描述，2 检验；Logistic 回归分析 LAPTM4B mRNA 水平的影响因素；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 87 例乳腺癌患者均为女性， 年龄33～69 岁，其中＞60 岁 56 例，≤60 岁 31 例；导管浸润性乳腺癌62 例，非导管浸润性乳腺癌25 例；肿瘤直径 14～64mm，其中＞20mm 40 例，21～50mm 29例，＞50mm 18 例；42 例合并腋窝淋巴结转移；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期50 例，Ⅲ～Ⅳ期37 例；雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性39 例，孕激素受体(progesterone receptor,PR)阳性42 例、人表皮生长因子受体-2 (human epidermal growth factor receptor-2,HE R2)阳性45 例、增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,Ki-67)阳性 23 例。

2.2 乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 水平 乳腺癌癌组织中LAPTM4B mRNA 水平为0.89（0.23,1.12）,显著高于癌旁组织的 0.17（0.03,0.66），差异有统计学意义（Z=7.814，P＜0.001），见图 1。

图1 乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 表达

2.3 不同病理特征的乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 水平 将乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 水平按中位数分高水平组（≥0.89，n=52）、低水平组（＜0.89，n=35）；不同年龄、肿瘤大小、ER 表达、PR 表达、HER2 表达的乳腺癌患者癌组织LAPT M4B mRNA 水平差异无统计学意义（P＞0.05）,但导管浸润性、 淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、Ki-67阳性的乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 高水平比例分别显著高于非导管浸润性、 无淋巴结转移、M 分期Ⅰ～Ⅱ期、Ki-67 阴性患者， 差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 不同病理特征的乳腺癌患者癌组织 LAPTM4B mRNA 表达（例，%）

2.4 乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 水平的Logistic 回归分析 将病理分型（导管浸润性=1、非导管浸润性=0）、淋巴结转移（有=1、无=0）、TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期=1、Ⅲ～Ⅳ=2）、Ki-67（阳性=1、阴性=0）作为协变量，LAPTM4B mRNA 水平（高水平=1、低水平=0）作为因变量行Logistic 回归分析，结果显示乳腺癌患者病理分型、淋巴结转移、TNM 分期及Ki-67 表达均是LAPTM4B mRNA 水平的独立影响因素，见表2。

表2 乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 水平的Logistic 回归分析

3 讨论

2015 年中国癌症统计数据显示乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤疾病,占女性恶性肿瘤疾病的60%，死亡率则占所有女性人的15%，也是导致45 岁以下女性死亡的主要原因之一, 严重危害女性健康[9]。现阶段乳腺癌的治疗主要以手术配合放化疗等着综合治疗为主,但放化疗药物存在多药耐药现象。随着分子生物学技术的发展，探寻可作为治疗靶点的分子生物学标记物于提升乳腺癌治疗疗效，并减轻化疗毒性至关重要。LAPTM4B 位于人染色体8q22.1，由7 个外显子及6 个内显子组成，广泛表达于机体组织。在妇科肿瘤疾病中，丁丽君等[10]证实子宫内膜癌患者癌组织LAPTM4B 蛋白存在异常高表达现象，认为LAPTM4B 蛋白与肿瘤分化程度、 淋巴结转移均是子宫内膜癌预后的独立影响因素。LAPTM4B 不仅调控细胞增殖、凋亡等生物学行为中扮演重要角色，且参与肿瘤多药耐药，但LAPTM4B 在乳腺癌中的表达及其临床意义类报道相对少见[11,12]。

往期研究报道，LAPTM4B 可激活P13K/AKT信号通路上调凋亡相关蛋白表达，如Bcl-2，并下调促凋亡蛋白Bax 表达, 使正常细胞发生恶性转化，促进恶性肿瘤疾病发生，在肝癌、前列腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤疾病中具可见LAPTM4B 异常高表达现象[13]。本研究显示,乳腺癌癌组织LAPT M4B mRNA 水平显著高于癌旁组织, 提示LAPTM 4B mRNA 在乳腺癌组织中呈过表达现象, 是乳腺癌中的过表达基因。这与往期报道结论相符[14]。为进一步分析LAPTM4B mRNA 表达在乳腺癌中的临床意义, 本研究将乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 水平按中位数分高表达组、低表达组；结果显示虽不同年龄、肿瘤大小、ER 表达、PR 表达、HE R2 表达的乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 表达差异无统计学意义,但导管浸润性、淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、Ki-67 阳性的乳腺癌患者癌组织LAPTM4B mRNA 高水平比例分别显著高于非导管浸润性、无淋巴结转移、M 分期Ⅰ～Ⅱ期、Ki-67阴性患者。由此可见，LAPTM4B mRNA 水平与病理分型、淋巴结转移、TNM 分期、Ki-67 表达密切相关。Logistic 回归分析也证实了上述结果，显示乳腺癌患者病理分型、淋巴结转移、TNM 分期及Ki-67表达均是LAPTM4B mRNA 水平的独立影响因素。

分析LAPTM4B mRNA 在乳腺癌中的作用机制，LAPTM4B mRNA 可通过上调 Cyclin D1、Cyclin E 表达促进细胞从G1 期进入S 期，促进恶性细胞证实； 另其也激活 integrin-α6 街道 P13K-AKT 信号通路、上调原癌基因表达参与细胞增殖及凋亡[15,16]。Meng 等[17]报道 LAPTM4B 缺失可导致增殖细胞核抗原、血管内皮生长因子、MMP2、MMP9 和CDK 12 表达降低，认为LAPTM4B 可能与卵巢癌细胞侵袭特征存在密切关联,或可成为卵巢癌治疗的潜在治疗靶点。隋思蕾等报道也显示乳腺癌中LAPT M4B 仅与淋巴结转移及TNM 分期相关，与肿瘤大小、脉管浸润、年龄、ER、PR、HER2 表达均无显著关联。这与本研究结论相似。但吕杨等[18]报道，LAP TM4B 表达水平仅与乳腺癌家族史有一定相关性，与分子分型、临床分期等均无显著关联，这与本研究结论存在差异。本研究中所有患者均无乳腺癌家族史， 因而未将家族史作为临床特征纳入研究范围， 另考虑可能与研究对象个体差异或样本量差异有关，这也在一定程度上反映LAPTM4B 与乳腺癌病理特征的关系仍有待补充及完善。

综上所述, 乳腺癌癌组织中新肿瘤相关基因LAPTM4B mRNA 表达高于癌旁症状组织，且乳腺癌病理分型、淋巴结转移、TNM 分期及Ki-67 表达均是LAPTM4B mRNA 表达的独立影响因素。