miR-542-3P 对肝细胞癌诊断和预后判断的临床价值研究

冯建超 ，周进学 ，靳根峰 ，刘勇

（1.河南省新郑市人民医院普外科，河南 新郑 451150；2.河南省肿瘤医院肝胆胰外科，河南 郑州 450008）

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,病死率位居所有肿瘤性疾病的第三位。我国是肝癌高发国家,发病率、死亡率一直处于较高水平[1,2]。近年来,随着生活结构的改变及饮食结构的调整,肝癌的发病率呈不断递增趋势,严重威胁我国居民的生命健康[3]。肝癌病情初期较为隐匿,临床症状不明显,且由于肝脏结构的特点,很难区分肝脏恶性肿瘤及肝脏局灶性良性病变,误诊率较高,只有少数患者能够在病情早期得到确诊及治疗, 多数患者出现临床症状时,已处于病情的中晚期,失去了最佳的手术时机,患者预后往往较差,复发率较高[4]。对肝癌进行早诊断、早治疗是降低死亡率、提高治疗效果的关键。寻找敏感度高、 特异度好的肝癌标志物对肝癌的治疗具有重要的意义。

微小 RNA （micro RNA,miRNA） 为一类长度19-24 个核苷酸的非编码RNA[5],与细胞的分裂、增殖、分化、凋亡、突变等多种生命活动密切相关[6],其中 miR-542-3p 位于 X 染色体的 q26.3 区域。近年来研究提示miR-542-3p 可通过抑制蛋白激酶抑制抑制肿瘤内皮细胞的增殖及分化,在多种肿瘤细胞中异常表达[7]。miR-542-3p 在肝癌组织细胞中的含量下调,且影响肝癌细胞的增殖、转移及侵袭[8],对于血清中miR-542-3p 的报道较少,在本次研究中以在该院接受治疗的60 例患者为研究对象,对患者血清中 miR-542-3P 的水平进行分析,进而为肝癌的诊断、治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取 2019 年 1 月至 2019 年 7 月在该院接受治疗的60 例肝癌患者为观察组, 其中男性患者为32 例,女性患者为28 例,年龄分布为39～72 岁,平均年龄为 49.28±9.68 岁。选取同时期的健康体检者60 例,其中男性患者33 例,女性患者 27 例,年龄分布为 41～75 岁,平均年龄为 50.36±8.58 岁,两组患者在年龄、性别方面无明显差异（P＞0.05）,具有可比性。所有患者均同意参与本次研究并签订相关文件,该研究经医院伦理学会批准。

纳入标准 年龄≥18 周岁,性别不限；已经病理学检查确诊为肝癌；依从性好,能够配合完成各项检查及治疗；精神正常,可进行正常沟通交流；自愿参加本次研究；临床资料完整。

排除标准 未被确诊的患者；合并心、肝、肾等重要脏器等重大疾病患者；合并其他恶性肿瘤的患者；存在精神障碍的患者；脱落标准 符合纳入标准,在研究过程中患者出现严重并发症或病情不稳定,急剧加重的患者；由于各种原因,患者主动退出者或失访患者；研究期间死亡的患者。

1.2 主要试剂及仪器 主要仪器：实时荧光定量PCR 分析仪（TL988-2；济南卓隆生物科技有限公司）；高速离心机（Optima XPN；贝克曼）；miRNA 逆转录试剂盒(德国 QIAGEN 公司)；RNA 提取试剂盒(上海华蓝化学科技有限公司)；反转录仪（StarScript；北京康润诚业生物科技有限公司）；高速匀浆机（FLUKFA25；德国弗鲁克）、超净工作台（SW-CJ-1D；苏州净化)； miR-106b 上游引物 5’-TAAAGTGCTG -ACAGTGCAGAT-3’（Invitrogen 公司）。

1.3 方法 ⑴血清中总RNA 的提取：清晨取静脉血10ml 置采血管中,静置10min 后5000r/min 离心10min,弃去沉淀,取 200μl 按照血清 RNA 提取试剂盒说明书提取总血清中RNA, 其余血清放-80℃冰箱保存备用。⑵合成cDNA 第一链 采用加尾法进行合成, 在 16℃ 30 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min,进行反转录,生成cDNA),结束后将cDNA 分装于EP管中,保存于-80℃冰箱保存备用。⑶实时荧光定量分析：加入底物、 试剂共计 20μl, 条件为：95℃15min,92℃ 15s,60℃ 30s,70℃ 35s,共计 40 个循环。对相应信号进行采集,每个点的信号取3 次,取平均值,采用Cei-miR-39 作为参照测定miRNA 的相对表达含量。

1.4 统计学方法 本次研究采用SPSS 20.0 统计学软件处理实验数据,计量资料采用进行表示,组间采用独立样本t 检验,计数资料用%表示,用卡方检验,P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-542-3p 的表达水平 对两组血清中的miR-542-3p 水平进行分析, 观察组治疗前血清中miR-542 -3p 为 1.76±0.65, 治疗后血清中 miR-542-3p 为2.26±0.71, 对照组血清中miR -542-3p水平为3.45±0.96,与对照组相比,观察组中血清中miR-542-3p 水平明显偏低, 且差异具有统计学意义（P＜0.05）。与治疗前相比,观察组血清中 miR-542-3p 水平明显升高,且差异具有统计学意义（P＜0.05）,见表 1。

表1 观察组及对照组血清中miR-542-3p 水平

2.2 临床参数与miR-542-3p 水平 对临床特征与miR-542-3p 之间的联系进行分析比较,不同年龄、肿瘤大小组血清组中miR-542-3p 水平无明显差异（P＞0.05）,不同分化程度、TNM 分期、淋巴结转移组血清中miR-542-3p 存在显著差异,分化程度越高、TNM 分期越高、 存在淋巴结转移血清中的miR-542-3p 的水平越低, 且差异存在统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

2.3 ROC 曲线 ROC 曲线分析显示miR-542-3p区分肝癌患者与正常人曲线下面积为0.8245（95% CI：0.7483～0.9008）,差异有统计学意义（P 值为 0.0283）。当截断值取 3.026 × 10-3时 ,敏感度与特异度分别为79. 2% 与75. 6%, 对肝癌的诊断具有一定价值。

表2 不同病理特征与miR-542-3p 水平

3 讨论

图 1 miR-542-3p 的 ROC 曲线

肝癌具有较高的发病率及致死率,严重威胁人类的生命安全,肝癌的病情进展较为隐匿,多数患者诊断时已处于晚期,失去了治疗机会,明确癌的影响因素对疾病的防治具有重要意义。但目前的发病机制尚不明确,但主要认为与年龄、饮食习惯及环境等有关,快速、准确的诊断方法对胃癌的治疗具有积极的促进作用,早诊断、早治疗是治疗胃癌的关键[9,10]。相关研究提示miRNA 在肝癌的发生及发展中起着重要作用,可对基因表达转录后进行调控, 在细胞的生命活动及癌变中起着重要的作用,miRNA 不仅存在于组织中, 同时也存在于外周血及其他体液中[11,12]。由于miRNA 与肿瘤细胞的增殖、分化关系密切,可作为血清标志物,在肿瘤疾病的诊断及治理中起着重要的作用。对于肝癌的诊断主要依据影像学资料及病理检查, 仍确实少快速、方便、准确的检查方式,miRNA 在肝癌中的诊断及预后价值成为研究的重点方向。

miR-542-3p 与多种肿瘤的发生、发展密切相关,在诸多肿瘤细胞中均表达异常。杨彬、于晶等[13]对微小miR-542-3p 在人脑胶质瘤中的表达及其对细胞增殖迁移能力进行了研究分析, 采用FQPCR 对脑胶质瘤患者肿瘤组织及颅脑外伤患者正常脑组织中miR-542-3p 的表达水平, 结果表明miR-542-3p 在脑肿瘤组织中表达水平明显降低,且具有抑制肿瘤细胞迁移及侵袭的作用。吴宁、陆瑛等[14]对miR-542-3p 在口腔鳞状细胞癌中的表达情况进行了研究分析,对患者癌组织及癌旁组织中miR-542-3p 的表达水平进行了测定,结果表明癌组织中的miR-542 -3p 水平明显低于癌旁组织,且差异具有统计学意义。miR-542-3p 水平与口腔鳞状细胞癌的发生发展关系密切,可作为疾病诊断的潜在标志物。在本次研究中肝癌患者血清中的miR-542-3p 水平明显低于正常人血清中miR-542-3p 的含量,且差异具有统计学意义,这与之前研究具有一致性,miR-542-3p 可降低肿瘤细胞对血管内皮的粘附力,抑制肿瘤细胞的转移,对肿瘤细胞的增殖、分化具有一定的抑制作用,同时有助于细胞的凋亡[15]。在本次研究中肿瘤分化程度越高、TNM 分期越高、 存在淋巴结转移血清中的miR-542-3p 的水平越低,且差异存在统计学意义。miR-542-3p 在肿瘤的诊断中敏感度高、 特异性好。岑小宁、黄许森等[16]对结直肠癌患者血清miR-542-3 p 水平进行了测定, 结果表明miR-542-3 p在直肠癌的诊断中,具有较高的灵敏度,特异度,可作为诊断结直肠癌的生物学标志物. 在本次研究中,ROC 曲线分析显示miR-542-3p 区分肝癌患者与正常人曲线下面积为 0.8245 （95% CI：0.7483～0.9008）, 敏感度与特异度分别为79.2% 与75.6%,在肝癌的诊治方面具有重要意义。

综上所述,miR-542- 3P 对肝癌的发生及发展具有一定的抑制作用, 在患者血清中表达水平较低,具有一定的灵敏度、特异度、对肝癌的诊断及预后具有一定价值。