转录因子Nrf2在口腔疾病中的研究进展

杨亚鑫,胡捷宇,陈淇枫,赵伊莎,常潇蒙,翟莎菲

(西安医学院口腔医学院口腔组织病理教研室,西安 710021;*通讯作者,E-mail:zhaishafei@xiyi.edu.cn)

核转录因子-E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是调节氧化应激反应的重要转录因子,在细胞抵抗各种应激中发挥着重要作用。机体受到应激可引起Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)解离并核向转移,入核的Nrf2结合抗氧化反应元件(ARE)调节抗氧化基因的表达,如转录血红素加氧酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、醌氧化还原酶1(NQO1)等,从而对细胞起到抗氧化保护作用。近年来研究发现,Nrf2在免疫反应和炎症中发挥防御作用,且参与调节癌症的发生发展、放化疗抵抗等。本文总结了Nrf2信号通路的组成和调节,以及与口腔疾病方面的研究进展。

1 Keap1-Nrf2-ARE信号通路简介

1.1 Nrf2的结构

Nrf2起初克隆自人类白血病细胞株(K562),并被鉴定为Cap-n-collar(CNC)碱性亮氨酸拉链转录因子家族的成员。Nrf2蛋白含有一高度保守的碱性亮氨酸拉链(basic region-leucine zipper,bZIP)结构,包含7个结构域,分别命名为Neh1-Neh7[1],见图1。Neh1是结合DNA的序列。Neh3-5是反式激活结构域,负责与共激活因子的结合。Neh2、Neh6和Neh7负责调节Nrf2的稳定。Neh1区域有bZIP结构,当Nrf2转位到细胞核,bZIP与细胞核内小Maf蛋白(small Maf proteins)组装成异源二聚体,使得Nrf2获得识别、结合抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)的能力,从而启动下游相关基因转录。此外,该结构域还可以与E2泛素结合酶相互作用,调节Nrf2的稳定性。Neh2是主要的调节功能域,包含了两个重要的保守区域DLG和ETGE,是Nrf2与胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)发生结合的区域,使得Nrf2能够稳定存在细胞质。Neh3位于C端,可与染色质解螺旋酶DNA结合蛋白6(a chromo-ATPase/helicase DNA binding protein,CHD6)相结合,促进ARE对相关基因转录的调控作用。Neh4、Neh5是参与启动下游基因转录的反式激活结构域,当Nrf2转位到细胞核内,以Nrf2-Maf的形式与ARE结合,但此时并不能启动转录过程,需要Neh4,Neh5和cAMP-反应元件结合蛋白(CREB binding protein,CBP)等结合后才能激活转录过程[2]。Neh6区域富含丝氨酸,是非Keap1依赖的Nrf2降解的调控区域[3]。Neh7是位于Neh5和Neh6域之间的新识别域。Neh7与一种核受体——视黄醇X受体α(RXRα)特异性结合,抑制Nrf2转录。

图1 转录因子Nrf2的结构示意图

1.2 Nrf2的活化调节

Nrf2的活性主要是通过与Keap1蛋白相互作用来调节的,Keap1指导转录因子进行蛋白酶体降解。Keap1是滞蛋白3(Cullin 3,Cul3)依赖性E3泛素连接酶复合物的作用底物,在机体生理环境下,Keap1-Cul3-E3泛素连接酶复合物能够泛素化修饰Nrf2,并靶向26S蛋白酶体进行降解,从而保持胞质中一定基础水平的Nrf2[4]。当细胞受到氧化应激等刺激诱导时,E3泛素连接酶的活性通过Keap1中的半胱氨酸残基的修饰而受到抑制,导致Nrf2与Keap1发生解离并转位到细胞核,与Maf蛋白形成异源二聚体并结合至细胞核内ARE,进而转录活化一系列抗氧化酶基因的表达,被称为Keap1-Nrf2-ARE通路(见图2)。Nrf2通路被激活后,启动下游多种抗氧化蛋白,解毒酶和异源转运蛋白的表达,如:血红素加氧酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)等。这些受调控的蛋白能减少氧化应激对脂质、DNA及蛋白质造成损伤,从而在增强细胞抗氧化和抗凋亡中发挥重要的作用。

图2 Keap1-Nrf2-ARE通路活化示意图

尽管普遍认为Keap1中一个或多个关键半胱氨酸残基的修饰(例如化学加成、氧化、亚硝酰化或谷胱甘肽化)代表了Nrf2活化的可能的化学生物学触发因素。但越来越多的文献揭示了Nrf2调控的其他机制[5],包括各种蛋白激酶(PKC,PI3K/Akt,GSK-3b,JNK)使Nrf2磷酸化,与其他蛋白伴侣(p21,caveolin-1)的相互作用和表观遗传因子(微小RNA-144,-28和-200a,以及启动子甲基化)。这些因子可能是Nrf2活性的重要决定因素,可能有助于维持细胞稳态。

2 Nrf2与口腔疾病

2.1 Nrf2与牙髓炎

近年研究发现一些化合物能调节Nrf2的表达。吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)是生长素类中最常见的植物激素,具有增强细胞增殖和抗氧化性能的作用。Kim等[6]发现IAA能通过激活与细胞存活、凋亡相关的Akt(蛋白激酶B,PKB),进而上调Nrf2的转录和其下游的HO-1表达,保护牙髓干细胞免受H2O2的毒性影响。肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)能通过活化Nrf2/HO-1,降低活性氧的水平,从而减少H2O2刺激引起的人牙髓细胞细胞凋亡[7]。

牙科树脂单体引起的氧化应激会导致重要细胞功能紊乱,并在受影响的细胞包括牙髓细胞中诱导细胞凋亡。Yang等[8]发现树脂单体甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)刺激促进Nrf2的核易位并增加Nrf2和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达,用Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(tBHQ)预处理人牙髓细胞可以保护细胞免受HEMA诱导的氧化损伤和线粒体损伤,并破坏了电子传输链。相反,用Nrf2抑制剂ML385进行预处理可提高细胞对这些有害过程的敏感性。并提出化合物表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对树脂单体引起的细胞毒性的保护作用是由Nrf2途径的激活介导的[9]。最低毒性浓度为100 μmol/L的酸性树脂单体10-甲基丙烯酰氧癸基磷酸二氢酯(10-methacryloyloxyde-cyl dihydrogen phosphate,MDP)可通过MAPK和NF-κB信号通路激活Nrf2介导的HO-1的表达,促进炎症反应,并抑制牙髓细胞分化为成牙本质细胞[10],提示靶向Nrf2可以保护牙髓细胞免受MDP诱导的炎症和损伤。

VEGF是由内皮祖细胞分泌的生长因子,它能增加血管通透性、血管内皮细胞的迁移、增殖和新生血管形成。VEGF的适度表达是牙髓生理性血管形成的前提,但其表达的调控可能涉及多种机制[11]。Yadlapati等[12]研究发现,搭载了VEGF的聚二恶烷酮纤维能促进小鼠根管中新生血管和结缔组织的形成,提示VEGF参与牙髓组织修复。Nrf2的缺乏可导致内皮祖细胞中VEGF的表达和分泌减少[13,14],Nrf2可以通过HO-1介导的缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)/VEGF信号通路调节血管生成[15]。Li等[16]研究发现,在脑微血管内皮细胞中,VEGF以细胞外信号相关激酶(ERK1/2)依赖性的方式激活Nrf2,上调HO-1的表达,从而促进CO的产生,而CO同时通过HIF-1α上调VEGF的表达,从而调节血管生成。提示Nrf2和VEGF可能通过正反馈回路参与损伤修复。

2.2 Nrf2与牙周炎

牙周炎是发生在牙支持组织上的炎症性感染性疾病。Nrf2基因敲除的慢性牙周炎大鼠表现出了更严重的局部氧化损伤和牙槽骨附着丧失[17],Nrf2激活剂白藜芦醇可预防牙周炎大鼠牙槽骨损失[18],说明Nrf2在牙周炎中具有一定的保护作用,这种作用可能主要通过抗氧化应激、抑制破骨细胞活化、调节间充质干细胞增殖分化和凋亡等方式发挥防御作用。

慢性牙周炎患者的氧化应激反应水平都较高,Sima等[17]发现在这些患者口腔的中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMNs)中,Nrf2及其下游的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)表达下调,可能是长期处于氧化应激状态下的PMNs产生的大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制了牙周炎患者的Nrf2活性[19],Nrf2功能的受损可能是牙周炎进展的重要因素。PMN及Nrf2参与牙周组织的固有免疫系统,会降低牙周炎的易感性和严重程度,上调Nrf2以诱导下游一系列抗氧化剂表达能够防御氧化应激引起的牙周损伤。

破骨细胞的过度活化导致的牙槽骨吸收是牙周炎的典型病理学表现。NF-κB受体活化因子配体(RANKL)能促进破骨细胞成熟并激活破骨细胞,Nrf2通路下游因子HO-1可抑制人工培养的牙周膜干细胞中的RANKL表达[20,21],通过Nrf2调节破骨细胞过度活化可能是控制慢性牙周炎牙槽骨吸收的新策略。

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周组织和牙根面之间形成新附着的主要细胞来源,Nrf2在其功能发挥中有积极作用。在H2O2处理氧化应激状态下的)PDLSCs模型中,Nrf2通过激活抗氧化酶、抵抗内源性细胞凋亡和降低胱天蛋白酶-3(caspase-3),B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)等凋亡相关分子的水平来抑制PDLSCs的凋亡和促进其增殖,而沉默Nrf2具有相反效果[22]。二甲双胍能促进Nrf2的入核及其在核中的表达,上调HO-1和NQO1等酶的水平,减轻氧化应激对PDLSCs增殖和成骨分化的损伤,当Nrf2被敲除时二甲双胍对PDLSCs的保护作用被消除[23]。

牙周炎发生时,牙周组织中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)数量减少,其增殖、分化、抗氧化、抗凋亡等功能严重受损,在临床试验中,基于牙周组织中的MSCs的干细胞疗法可以有效地修复牙周炎引起的骨缺损[24]。Yoon等[25]的研究指出,增强Nrf2入核能提高人骨髓中MSCs的增殖能力和成骨分化潜能。刘荣强等[26]通过研究发现,在MSCs中增加Nrf2通路下游HO-1的表达能提高MSC的抗氧化和抗凋亡能力。提示Nrf2对MSCs的功能调节在牙周炎治疗中可能发挥着重要的作用。

对Nrf2的调节研究发现miR-200a表达能激活Nrf2信号传导,从而抑制地塞米松诱导的活性氧生成和成骨细胞的死亡/凋亡[27]。姜黄素对软骨细胞氧化应激损伤有保护作用,可通过增强Nrf2表达实现[28]。褪黑素能通过MT1/MT2受体途径激活Nrf2,抑制内质网应激,减轻脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)的衰老,并提高移植的cADMSCs的功效[29]。提示调节Nrf2及下游一系列抗氧化因子的表达可能成为治疗牙周炎的重要思路。

2.3 Nrf2与口腔癌

氧化应激在口腔癌的发展中起重要作用。4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)诱导的小鼠口腔癌模型已被广泛用于研究,这可能与4NQO直接产生ROS和间接消耗GSH,产生的氧化应激,从而生成氧化性DNA损伤有关[30]。Lan等[31]在人口腔白斑病变组织中观察到NRF2的活化入核积累;在体外口腔角质形成细胞和体内小鼠舌头中用Nrf2的激活剂萝卜硫素(sulforaphane,SFN)预处理可抑制4NQO造成的氧化损伤;在野生型和Nrf2-/-小鼠研究中也表明SFN的局部应用可激活NRF2途径,抑制氧化损伤并以Nrf2依赖性方式阻止口腔癌变[32],提示Nrf2可能成为口腔癌症防治的靶标。

PI3K-Akt信号通路可通过调控Nrf2的表达参与细胞增殖和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节,此通路的激活常与多种癌症相关。在缺陷抑癌基因PTEN的细胞中,PI3K-Akt信号通路激活,抑制GSK-3β活性,导致Nrf2上调,从而显示出更高的细胞增殖[33]。在Mitsuishi等[34]的实验中发现激活PI3K-Akt信号通路可上调Nrf2,Nrf2促进谷氨酰胺代谢和嘌呤核苷酸的合成,从而促进细胞代谢和增强细胞保护。激活的Nrf2可进一步激活PI3K-Akt信号通路,两者积极的反馈可能加速癌症的进展。

癌症干细胞(cancer stem cells,CSC)具有自我更新、无限增殖的特性,在富含CSC的乳腺小球中发现Nrf2高表达[35]。Nrf2与控制干性相关的Notch信号通路密切相关。研究发现Keap1-/-的小鼠舌鳞状上皮细胞导致增殖细胞核抗原(PCNA)基因的转录增加和Notch1 mRNA、Notch1细胞内域以及Notch信号通路下游因子家族BHLH转录因子1的蛋白水平显著上升,导致舌鳞状上皮细胞增殖[32]。Notch1敲低导致头颈部鳞状细胞癌CSC标志物的水平降低,抑制癌细胞增殖[36]。提示抑制Nrf2表达可能通过抑制Notch信号通路损伤CSC增殖特性,从而有利于头颈部鳞状细胞癌的治疗。

铁死亡是近年来发现的一种细胞死亡形式,主要以铁依赖的脂质ROS产生为特点,而脂质ROS的清除主要依赖于谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4),GPX4是铁死亡的调节器,其抑制作用可能使抗治疗的癌细胞容易发生铁死亡[37]。Nrf2-ARE途径的激活促进了头颈癌(head and neck cancer,HNC)细胞对GPX4抑制的抗性,并且对该途径的抑制逆转了HNC对铁死亡的抗性[38]。此外,Nrf2在癌症中的表达会促进肿瘤对化疗药物的抵抗力。因此,抑制Nrf2能逆转顺铂耐药的头颈癌细胞对青蒿琥酯诱导的铁死亡的抵抗力,从而为头颈癌提供新的治疗思路。此外,自噬受体蛋白p62与Keap1之间相互作用,p62的磷酸化使p62对Keap1的结合亲和力显著增加,从而上调Nrf2的表达,保护细胞免受ROS的影响[39]。在肝癌细胞中发现激活p62-Keap1-Nrf2信号传导途径可上调Nrf2下游NQO1和HO-1的表达,从而抑制肿瘤细胞铁死亡,促进肿瘤进展[40]。以上研究提示Nrf2介导的抗氧化过程、自噬和铁死亡三者关系密切。对Nrf2与不同信号通路的关系及Nrf2与肿瘤耐药的机制研究,将有助于提高口腔癌和头颈癌的疗效。

3 结语

Nrf2是内源性抗氧化系统的核心转录调节因子,在抗氧化、抗炎及免疫反应中发挥细胞防御作用。氧化应激、炎症损伤与口腔疾病密切相关。Nrf2可以保护牙髓细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡和修复材料诱导的炎症损伤。Nrf2在牙周炎中具有一定的保护作用,主要通过抗氧化应激、抑制破骨细胞活化、调节间充质干细胞增殖分化和凋亡等方式发挥防御作用。Nrf2活化参与口腔癌的发生发展,抑制Nrf2过表达有助于提高口腔癌化疗疗效。深入探索Nrf2在口腔疾病中的作用机制,可为研究或临床提供更好的思路和靶标。