环保酵素的微生物检测和生化成分分析

饶毅萍魏建华陈冬娥张彩云张淑怡

(1.汕头职业技术学院，广东 汕头 515041；2.汕头海关技术中心，广东 汕头 515041)

环保酵素是泰国乐素昆·普潘翁博士经过30a努力研发的一种果皮、蔬菜叶等厨余酵素，通称为“垃圾酵素”，是对混合了红糖和水的厨余鲜垃圾经过厌氧发酵后所产生的棕色液体的通俗称法[1]。经过科学论证，环保酵素被证实在污水处理、净化水体[2,3],土壤改良修复[4-11],影响植物生长[7,8,12,13],农药降解、植物虫害[14,15],医药应用等方面[16]均能发挥一定效用。环保酵素的生产简单易做，全过程不使用任何化学合成物质，具有加工原料随处可得、工艺简单、成本低廉等优点[1]，因而越来越多地被普通大众所接受，逐渐走进家庭、办公室、工厂和田间地头，渗透进国民大众的日常生活中。但家庭自制的环保酵素，在发酵材料、发酵用具、发酵条件、发酵工艺和后期处理等方面都较为随意、简易；菌群未完全鉴定清楚，成分未完全检测清楚，也未作毒理分析。本研究对环保酵素的微生物环境、主要功效酶活力和有机酸成分进行检测分析，以期为人们认识和使用环保酵素提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 环保酵素制取

根据乐素昆·普潘翁博士(Dr.Rosukon Poompanvong)研发的配方和制做方法，自制单一环保酵素和混合环保酵素。具体是单一环保酵素用m(红糖)∶m(苹果)∶m(水)=1∶3∶10，混合环保酵素用m(红糖)∶m(苹果1加梨1加橙1)∶m(水)=1∶3∶10，在塑料瓶中密闭发酵3个月。发酵完毕，用4层纱布滤去酵素渣，留取环保酵素液备用。

1.2 方法

1.2.1 环保酵素微生物检测

环保酵素制成后，从当天开始，每相隔14d，即于第1天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天分别检测2种环保酵素的细菌菌落总数、酵母菌和霉菌数量。菌落总数测定参照GB4789.2-2016；霉菌和酵母计数参照GB4789.15-2016。

于环保酵素制成后第30天，检测2种环保酵素大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌等4种致病菌的情况。其中，大肠菌群计数参照GB4789.3-2016；沙门氏菌检验参照GB4789.4-2016；志贺氏菌检验参照GB4789.5-2012；金黄色葡萄球菌检验：参照GB4789.10-2016。

1.2.2 环保酵素主要功效酶活力测定

于环保酵素制成后第30天，测定2种环保酵素蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶的酶活力情况。其中，蛋白酶活力测定采用福林法，参照GB/T 23527-2009；脂肪酶活力测定采用指示剂滴定法，参照GB/T 23535-2009；α-淀粉酶活力测定参照GB/T 24401-2009。

1.2.3 环保酵素有机酸的定性和定量测定

于环保酵素制成后第30天，采用高效液相色谱法测定2种环保酵素中酒石酸、乙醇酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、D-苹果酸的含量。具体参照《化妆品安全技术规范(2015版)》中3.1α-羟基酸的测定方法。

2 结果与分析

2.1 环保酵素的主要微生物分析

环保酵素制成后，人们的使用期一般为2～3个月。通过在此期间每相隔14d进行1次对环保酵素中的细菌、酵母菌和霉菌菌数的测定，其结果见表1、2。

表1 不同时间单一环保酵素细菌、酵母菌和霉菌菌数

表2 不同时间混合环保酵素细菌、酵母菌和霉菌菌数

由表1、表2可知，无论是单一环保酵素还是混合环保酵素，在70d中，其细菌数和酵母菌数都呈现数量级稳定且上升的趋势，混合环保酵素的菌数明显高于单一环保酵素；2种环保酵素的霉菌保持在一定的数量级。分析说明，环保酵素一直保持带菌状态，具有稳定的微生物生态环境，且发酵原料不同制成的环保酵素菌数数量有差异。这是大众使用环保酵素时要认识到的。对于入口、入眼、接触伤口时就要谨慎行事了。

2.2 环保酵素的主要致病菌分析

本研究对环保酵素进行了4种主要致病菌的测定，其结果见表3。

由表3可知，2种环保酵素均未检测到上述4种主要致病菌。由于受条件所限，本研究并未对环保酵素进行所有致病菌的检测，因而不能说明环保酵素不存在其它致病菌。仅能说明在某一时间时，环保酵素未检测到大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌。建议使用环保酵素时，仍应小心注意，最好进行消毒灭菌后使用更佳。

表3 环保酵素主要致病菌菌数

2.3 环保酵素主要功效酶的酶活力分析

酵素始称为“酶”，易被认为环保酵素之所以有效用是因为其中含有多种功效酶。本研究对环保酵素的蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶的酶活力进行测定，其结果见表4。

表4 环保酵素主要功效酶活力

由表4可知，2种环保酵素均具有一定的蛋白酶和脂肪酶，但酶活力都极低。2种环保酵素都未检测出α-淀粉酶。分析说明，环保酵素并非靠含有多种酶或含有较高的酶活力而发挥作用的。

2.4 环保酵素有机酸的定性和定量分析

通过高效液相色谱法得出了酒石酸、乙醇酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、D-苹果酸的标准品色谱分离图，见图1。表5列出了6种有机酸的标准曲线线性相关性。2种环保酵素经高效液相色谱法测定，其酒石酸、乙醇酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、D-苹果酸的含量见表6。

表5 6种有机酸标准曲线线性相关性

表6 环保酵素有机酸的含量

图1 有机酸标准品色谱分离图

由表6可知，2种环保酵素均含有酒石酸、乙醇酸、L-苹果酸、乳酸和D-苹果酸。混合环保酵素还含有柠檬酸，单一环保酵素不含柠檬酸。2种环保酵素有机酸的含量高低不同。可见发酵原料不同，其有机酸的种类和浓度也有差异。环保酵素含有有机酸，与环保酵素呈酸性、具有特殊的气味有关，且与环保酵素具有一定的家居洗涤去污作用有关。

3 结论

环保酵素具有稳定的微生物生态环境，一直保持一定数量级的细菌、酵母菌和霉菌菌数。未检测到环保酵素中含有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌等4种致病菌。未检测到环保酵素含有α-淀粉酶，而蛋白酶和脂肪酶酶活力都极低。环保酵素含有酒石酸、乙醇酸、L-苹果酸、乳酸和D-苹果酸等有机酸，混合环保酵素还含有柠檬酸。发酵原料不同，环保酵素的微生物数量，有机酸种类和浓度也有差异。