基于网络药理学分析山慈菇-浙贝母药对治疗乳腺癌的作用机制

杨卜瑞 贺小芳 师晶晶 张铃枝 陈晓静 李廷荃 杨丽芳

摘要 目的：基于网络药理学探讨山戀菇-浙贝母药对治疗乳腺癌的作用机制。方法：采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）收集山慈菇、浙贝母的活性成分和靶点，并通过Uniprot数据库选择对应的药物作用蛋白质名称对应基因名，通过Cytoscape3.7.2构建“药物-活性成分-靶点”网络图，同时检索疾病数据库（GeneCards）和在线人类孟德尔遺传数据库（OMIM）获得乳腺癌相关靶点。使用Cytoscape3.7.2构建“活性成分与乳腺癌交集靶点”蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并对PPI网络节点进行筛选，得出关键靶点;运用Metascape数据库对关键靶点进行基因本体（GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：研究从山慈菇-浙贝母药对中筛选获得10个重要活性成分，包括β-谷固醇，豆甾醇，2-甲氧基-9，10-二氢菲4，5-二醇，哲贝瑞醇等，作用于FUS和RPL24等71个关键靶点。C0富集分析共鉴定出31个条目，包括细胞组分3项、分子功能8项、生物学过程20项。此外，KEGG富集通路分析共确定了14条富集通路。结论：山慈菇-浙贝母药对治疗乳腺癌的作用体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点，其作用机制可能是通过调控癌症途径、调控信号通路途径、调控介导细胞成熟和改变细胞周期等多个方面发挥治疗乳腺癌的作用。本研究为后续进一步研究提供思路和借鉴。

关键词 网络药理学;山慈菇;浙贝母;药对;乳腺癌;肿瘤;作用机制;靶点

中图分类号：R273;R285

文献标识码：A

doi：10.3969/[J].is.1673-7202.2021.21.007

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈现逐年上升趋势。有研究表明，我国乳腺癌患者5年生存率为83.2%山，在我国，乳腺癌在城市中的发病率为女性恶性肿瘤的第2位，在一些大城市中已上升至第1位，已经成为妇女健康的最大威胁。目前，乳腺癌的治疗以手术、放疗、化疗以及内科综合治疗为主。但手术和放疗、化疗后脉络损伤、气机受阻、气滞血瘀、瘀血内停、津液出入受阻，易发生皮下积液、皮瓣坏死、上肢水肿、肝肾损伤，影响机体代谢2，因此，中医药以其不良反应小、疗效好的特点为乳腺癌患者多种并发症的治疗带来了新的思路。山慈菇，为兰科杜鹃兰属植物杜鹃兰或独蒜兰属植物独蒜兰的假鱗茎。味甘、辛，性凉，归肝、脾经，具有清热解毒，消肿散结之功效。现代药理研究表明：B-谷固醇，豆甾醇，2-甲氧基9，10-二氢菲4，5-二醇是其主要活性成分。浙贝母为百合科植物浙贝母的鳞茎，味苦，性寒，归肺、心经，有清热化痰、散结消痈的功效。其主要活性成分为生物碱、多糖和总皂苷等，具有抗溃疡、镇痛、镇咳祛痰、改善肺功能、抗炎、抗氧化、抑制细胞增殖、逆转耐药等功效4。其中胡凯文等的发现贝母素甲及贝母素乙对人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR可逆转耐药5倍以上有效改善乳腺癌的耐药。同时，临床疗效及药理研究均表明，山慈菇、浙贝母二者配伍，相须为用，在乳腺癌等实体肿物的治疗中可增强软坚散结的作用，改善乳腺癌局部红肿热痛症状，抑制瘤體生长。尽管山慈菇-浙贝母是乳腺癌临床中医治疗的常用药对，然而其具体作用基因靶点尚不明确，这在一定程度上限制了山慈菇浙贝母药对在临床的推广使用。网络药理学作为一门新兴学科，旨在通过药物基因-疾病相互作用分析关系，将传统中药与现代药理学、分子生物学、生物信息学相整合，并为中医药药对在抗击乳腺癌的过程中提供分子药理学证据，为乳腺癌的现代中医诊疗提供新思路。本课题通过采用网络药理学方法从基因水平分析山慈菇-浙贝母的有效成分，预测其作用靶点及相关信号通路，阐释山慈菇-浙贝母药对在抗击乳腺癌过程中的作用机制，为临床乳腺癌的治疗提供依据。

1材料与方法

1.1山慈菇-浙贝母有效成分的收集和筛选在计

算机生物实验室中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatebaseAnalysisPlatform，TCMSP，https：//tcmspwcom/tcms.php）中药数据库，分别检索山慈菇和浙贝母的所有化学成分，其中山慈菇18个、浙贝母17个。为更好地筛选山慈菇浙贝母药对中的有效化合物，本研究结合口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18作为活性成分的筛选条件。

1.2药物靶点基因的筛选在TTCMSP中根据筛选

出的药对活性分子选择对应的蛋白靶点，删除无靶点信息的活性成分。通过Uniprot（htts：//sparql.uniprot.org/）蛋白质数据库将收集的药物作用靶点转化为基因名称，物种来源为“Homo sapiens”，同时删除无效靶点，将药物基因名称标准化处理后录入Excel表格。

1.3乳腺癌靶点基因的筛选利用在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org/）iiGenecards（https：//www.genecards.org/）疾病数据库检索关键词breastcancer，获取乳腺癌相关的基因靶点，同时合并2个疾病数据库的搜索结果，去除重复和假阳性的基因，选择score》15作为疾病靶点筛选的标准。

1.4构建中药活性成分-靶点网络使用Cyto-scape3.7.2软件构建山慈菇-浙贝母药对治疗乳腺癌的“中药-活性成分-靶点”网络，网络图中的节点分别为药物名称、化学成分、澘在靶点。其中化学成分与潜在靶点之间有相互作用关系的以边相连，使用NetworkAnalysis插件对相应网络进行拓分析。

1.5蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建与分析使用Cytoscape3.7.2的Biso Genet插件分别构建“药物靶点蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein InteractionPPI）网络”和“乳腺癌靶点PPI网络”。通过”Merge"'功能对2个PPI网络取交集，获得交集网络。使用“analyze network”'功能对网络拓扑参数进行分析，分析内容包括Degree、Betweenness

Centrality，Closeness Centralityfll Neighborhood Ceon-nectivity。通过Degree、BC、CC和NC指标筛选关键靶点，并从关键靶点中筛选出活性成分和乳腺癌直接相关的靶点作为核心靶点。

1.6基因本体分析和京都基因与基因组百科全书富集分析利用Metascape数据库对上述得到的核心靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以了解“山慈菇-浙贝母”药对的主要成分对于乳腺癌的GO功能和药对主要成分的靶标蛋白在信号通路中的作用，然后把数据信息录人微生信平台进行可视化处理。

2结果

2.1山慈菇-浙贝母有效成分的收集和筛选共收集到山慈菇化学成分18个，浙贝母化学成分17个。筛选山慈菇有效成分3个，浙贝母有效成分7个，山慈菇和浙贝母共有活性成分1个：β-谷固醇。见表1。

2.2药物靶点的筛选收集删除无对应靶点信息活性成分Ziebeimine和Chaksine和重复活性成分beta-sitosterol。共得到7个活性成分及对应的131个作用靶点，标准化后共获取71个对应靶点。

2.3中药-活性成分-靶点网络绘制的“药物活性成分-靶点”网络图中共包括76个节点，127条边。网络中黄色节点代表药物，粉色节点代表活性成分，红色节点代表靶点。网络拓扑分析提示：4种活性成分能与10个以上的靶点连接，β-谷固醇（Degree=37）、豆甾醇（Degree=28）和2-甲氧基9，10-二氢菲4，5-二醇（Degree=27）3种活性成分能与20个以上靶点连接，Pelargonidin（Degree=15）1种活性成分能与10个以上靶点连接，因此可认为上述4个活性成分是“山慈菇-浙贝母”药对的主要活性成分。见图1。

2.4成分靶点PPI网络构建共获得与药物化学成分直接或间接相关的作用靶点3187个，相互关系77135条;对乳腺癌作用的1766个靶点构建PI网络，获得与乳腺癌相关活性成分直接或间接作用靶点12249个，相互关系237624条。将2个PPI网络通过Intersection求交集，得到1个有3124个靶点，76656条相互关系的网络。筛选交集网络的关键靶点。在交集网络中，Degree的中位数为28。见图2。

筛选出Degree》=58的子网络包含862个靶点和36680个靶点与靶点的相互关系。由于靶点数量较多，故对子网络进行二次筛选。子网络的Degree BC、CC、NC的中位数分别为93、6.656×100.405、138.224，选择Degree≥93、BC=6.656×10-3、CC=0.405、NC=138.224的靶点作为关键靶点，最终得到关键靶点168个，靶点间相互关系2762条。168个关键靶点中前10个与活性成分和乳腺癌均直接相关的靶点分别为：FUS（Degree=72）、RPL24（Degree=69）、RPS2（Degree=67）、EIF4A3（Degree=65）、RPL6（Degree=65）、CUL4B（Degree=64）、TUBGI（Degree_=64）、RPL7反应、凋亡信号通路、生殖结构发育及髓系细胞分化的正调控等多个生物过程。对14条KEGG信号通路进行分析，发现山慈菇-浙贝母药对治疗乳腺癌的信号通路主要集中为3类，1）调控癌症途径hsa05200信号通路、k005210信號通路、hsa0522等多条信号通路通过诱导凋亡发挥抗癌作用。2）信号通路途径：hsa04915KEGG通路、k04657KEGG通路等多条信号通路与乳腺癌治疗密切相关。其中雌激素受体阳性是导致乳腺癌死亡的主要因素hsa04915信号通路通过参与雌激素信号调节发挥治疗乳腺癌的作用。ko04657信号通路参与L-17的表达，乳腺癌糖酵解活性的增强与促肿瘤免疫有关，而肿瘤糖酵解与免疫/炎症功能之间的相互作用可以通过-17信号转导途径介导。3）介导细胞成熟和改变细胞周期：hsa04914、ko04972、ko04110等多条通路通过孕酮介导的卵母细胞成熟、影响胰腺分泌以及调控细胞周期共同发挥抗癌作用。

本研究运用网络药理学的方法，对山慈菇-浙贝母药对治疗乳腺癌的作用机制进行研究，研究表明，山慈菇-浙贝母药对主要通过β-谷固醇、豆甾醇、2甲氧基9，10-二氢菲4，5-二醇、pelargonidin、嘧啶、哲贝瑞醇、6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1，4-禁醌8-0-βD-吡喃葡萄糖苷等活性成分，调节FUS、RPL24等相关靶点的表达，进而干预hsa05200、hsa05161koO5210、hsa04915、ko04933、ko04657、hsa05222hsa04919、ko05164、hsa05215、ko04370、hsa04914ko04972、ko0410等多条乳腺癌相关通路，从调控癌症途径、调控信号通路途径、调控介导细胞成熟和改变细胞周期等多个方面发挥治疗乳腺癌的作用。山慈菇-浙贝母药对治疗乳腺癌的作用机制体现了山慈菇-浙贝母药对多靶点、多通路协同作用的特点。本研究可为中药药对参与乳腺癌治疗提供思路和借鉴，也为临床应用提供一定的依据。

参考文献

[1] National Health Commission of the Peoples Republic of China. Chi-nese guidelines for diagnosis and treatment of breast cancer 2018（ English version）[J].Chin J Cancer Res， 2019， 31（2）： 259-277

[2]吴松涛，周双，解染，等，治疗乳腺癌的抗体药物硏究进展[J].中国新药杂志，2019，28（24）：2954-2959

[3]赵金凯，杜伟锋，应泽茜，等.浙贝母的现代研究进展[J].时珍国医国药，2019，30（1）：17-180

[4]王翰华，杨晓春，崔明超.浙贝母叶与浙贝母花醇提物的止咳、化痰及平喘活性研究[J].天津医药，2016，44（10）：1225-1228

[5]胡凯文，郑洪霞，齐静.浙贝母碱逆转白血病细胞多药耐药的研究[J].中华血液学杂志，1999，20（12）：650

[6]董海玲，郭顺星，王春兰，等.山慈菇的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2007，38（11）：1734-1738

[7]世界中医药学会联合会.网络药理学评价方法指南[J].世界中医药，2021，16（4）：527-532.

[8]Vo TK， Ta Q， Chu QT， et al. Anti-hepatocellular-cancer Activity Ex-erted by B-sitosterol and B-sitosterol-glucoside from Indigoferazollingeriana Mig[J]. Molecules， 2020， 25（13）： 3021

[9] Munhoz A， Frode TS Isolated Compounds from Natural Products with Potential Antidiabetic Activity-a Systematic Review[]. Curr Diabetes Rev，2018，14（1）：36-106

[10] Bae H， Song G， Lim W. Stigmasterol Causes Ovarian Cancer Cell Ap-optosis by Inducing Endoplasmic Reticulum and Mitochondrial Dys-function[J]Pharmaceutics， 2020， 12（6）： 488.

[11]Pandey P， Bajpai P， Siddiqui MH， et al. Elucidation of the Chemo preventive Role of Stigmasterol Against Jabl in Gall Bladder Carcino-ma[[J]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets， 2019， 19（6）826-837

[12]Greenlee H， Dupont-reyes MJ， Balneaves IG， et al. Clinical practiceguidelines on the evidence-based use of integrative therapies duringand after breast cancer treatment [J]. CA Cancer J Clin， 2017， 673）：194-232

[13] Fu K， Chen M， Zheng H， et al. Pelargonidin ameliorates MCAO-IN duced cerebral ischemia/reperfusion iniury in rats by the action onthe Nr2/HO-1 pathway[J]. Transl Neurosci， 2021， 12（1）： 20-31

[14] Ghattamaneni N， Sharma A， Panchal SK， et al. Reply to： Pelargonidin and its glycosides as dietary chemopreventives attenuating inflam-matory bowel disease symptoms through the aryl hydrocarbon receptor[J]. Eur J Nutr，2020，59（8）：3865-3866

[15] Dormann D， Haass C Fused in sarcoma（FUS）： an oncogene goes a-wry in neurodegeneration[J]. Mol Cell Neurosci， 2013， 56： 475-486

[16]Nakaya T Dissection of FUS domains involved in regulation ofSNRNP70 gene expression[J].FEBS Lett， 2020， 594（21）： 35183529

[17]Xie P， Guo Y. LINC00205 promotes malignancy in lung cancer byrecruiting FUS and stabilizing CSDE1 [J].Biosci Rep， 2020， 40（10）：BSR20190701.

[18]baloglu MC， Ulu F， Altunoglu YC， et al. Identification， molecularcharacterization and expression analysis of RPL24 genes in three Cucurbitaceae family members： cucumber， melon and watermelon[J]Biotechnology Biotechnological Equipment， 2015， 29（6）： 10241034

[19]Zhao Y， Zhao C， Lu J， et al. Sesterterpene MHO7 suppresses breastcancer cells as a novel estrogen receptor degrader [J]. Pharmacol Res，2019，146：104294.

[20] Li W， Xu M， Li Y， et al. Comprehensive analysis of the associationbetween tumor glycolysis and immune/inflammation function inbreast cancer [J].Transl Med， 2020， 18（1）： 92

（2020-11-30收稿責任编辑：王明

基金项目：国家自然科学基金面上项目（8187474）——鹿茸通过P3KAKT信号通路调控EPCs动员及归巢促进PAD大鼠血管新生的作用机制;山西省重点研发计划项目（201803D31203）蟾蜈止痛膏治疗中重度癌性疼痛的临床研究;萧氏脾胃学术流派传承工作室建设项目（2020PY-LP-08）

作者简介：杨卜ト瑞（1993.12-），男，硕士研究生在读，研究方向：中医肿瘤，E-mai：870112459@qq.com

通信作者：杨丽芳（1967.05-），女，硕士，主任医师，研究方向：中医肿瘤，E-mail：784788532@q.com