黄土高原半干旱区轮作休耕模式对土壤真菌的影响

南丽丽,谭杰辉,郭全恩

1 甘肃农业大学草业学院, 兰州 730070

2 甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所, 兰州 730070

耕地质量下降是中国农业可持续发展的主要限制性因素[1]。在以小麦—玉米周年种植制度为主的黄土高原,长期的集约化种植使耕层浅薄化、土壤紧实化、养分利用率较低等一系列土壤健康问题尤为突出[2]。为了坚守耕地红线,保障国家粮食安全,更好地实施“藏粮于地、藏粮于技”战略,实现节约地下水、保护生态环境的目标,国家提出在河北省地下水漏斗区、湖南省长株潭重金属污染区、贵州省和云南省石漠化区和甘肃省生态严重退化区作为我国的休耕试点区[3]。这对提高我国土壤质量、促进农业提质增效[4]、维护食品安全和保障生态安全均具有重要意义。

微生物量碳氮和酶活性作为土壤微生物活性的重要指标,是土壤养分转化和有机质分解的关键因子,常被用于评价土壤质量的生物学特性[5]。土壤微生物是土壤的重要组成成分,释放土壤酶,参与有机质降解、腐殖质合成、养分循环等生物化学过程[6],被认为是最敏感的土壤质量生物学指标。土壤真菌作为土壤微生物的重要组成部分,在土壤营养元素循环、有机质的形成和分解、土壤肥力的提高和保持、生态环境的改善等方面有非常重要的作用[7]。土壤真菌是生态系统健康的指示物,与细菌相比,真菌能更好地降解复杂化合物[8]。研究表明,种植方式[9- 10]、耕作措施[11- 12]、轮作[13]、秸秆还田[14]、绿肥还田[15]、施肥种类[16- 17]等会影响土壤真菌群落多样性。因休耕、残膜覆盖、伏天深耕、施有机肥、秸秆还田和绿肥还田能够改善土壤水、肥、气、热等条件,其有机物输入的类型有差别,引起土壤微生物群落和功能的变化。为此,本研究选择黄土高原半干旱休耕试点区,利用常规分析和高通量测序技术研究了不同轮作休耕模式对土壤生物特性和真菌群落的影响,并结合FUNGuild工具预测真菌功能营养型,探索不同轮作休耕模式影响黄土高原半干旱区土壤肥力的生物学机制,为保持地力、可持续利用土地资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地位于甘肃省永靖县新寺乡大湾岘村(36°00′ N,103°12′ E),地处陇西黄土高原丘陵沟壑区,境内山大沟深,土质疏松,水土流失严重,属温带半干旱偏旱气候类型,海拔1957 m,年均温8.7 ℃,>10 ℃积温2750 ℃,年均降雨量260 mm,且年际、季节性分布不均,降雨主要集中在7—9月,蒸发量高达1500 mm。土壤类型为黑垆土,0—20 cm土层的pH值为8.24,全氮、全磷、全钾、有机质含量分别为1.09、0.15、8.25、3.45 g/kg。

1.2 试验设计

于2017年5月设置9种轮作休耕模式(表1),小区面积56 m2(7 m×8 m),区间距80 cm,完全随机设计,3次重复。豆科绿肥作物豌豆(Pisumsativum)、毛苕子(Iiciavillosa)、箭筈豌豆(Viciasativa)播量分别为90、45、70 kg/hm2,播深3 cm,行距30 cm。第3年(2019年9月21日)用土钻在各小区按“S”形路线5点取样法采取0—20 cm土层土样,每小区3次重复。土样混匀后分为两份装入已灭菌袋中用冰盒迅速带回,一份在4℃冰箱中保存用于土壤生物学指标测定,另一份在- 80℃冰箱中保存用于土壤微生物总DNA提取。

表1 不同轮作休耕模式Table 1 Different fallow rotation modes

1.3 土壤生物学性质测定

土壤微生物量碳(soil microbial biomass carbon,SMBC)[18]、氮(soil microbial biomass nitrogen,SMBN)[19]采用氯仿熏蒸法测定,SMBC=EC/KEC,EC=熏蒸土壤有机碳质量分数-未熏蒸土壤有机碳质量分数,KEC：转换系数,取值 0.38；SMBN=EN/KEN,EN=熏蒸土壤全氮质量分数-未熏蒸土壤全氮质量分数,KEN：转换系数,取值 0.45。

土壤脲酶(Urease activity,UA)采用靛酚蓝比色法[20],以24 h后1 g土壤中NH3-N质量(mg)表示；碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase activity,APA)采用磷酸苯二钠(用硼酸缓冲液)比色法[20],以24 h后1 g土壤中释放出的酚质量(mg)表示；脱氢酶(Dehydrogenase,DA)采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法测定,以24 h后1g土壤生成TTC的质量分数表示(mg/g)[20]；过氧化氢酶(Catalase activity,CA)采用紫外分光光度法[20],以20 min内1 g土壤中分解过氧化氢的质量(mg)表示；有机质(Organic matter,OM)采用重铬酸钾容量法(外加热法)测定[21],pH值采用土水比1∶5悬液用pHS- 4智能酸度计测定[21]。

1.4 土壤DNA提取与真菌ITS基因扩增

土壤真菌DNA基因组采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyammonium ammonium bromide)法提取。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA的纯度和完整性,用超微量紫外分光光度计ND- 2000(Nanodrop Technologies,美国)测定所提 DNA的浓度与纯度。选择ITS1可变区,以稀释的基因组DNA为模板,使用ITS5- 1737F和ITS2- 2043R引物和高效高保真酶进行PCR,确保扩增效率和准确性。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量,文库合格后,使用NovaSeq6000进行上机测序(北京诺禾致源生物信息科技有限公司),每个处理3次重复。

1.5 数据统计

经过 QIIME(v1.8.0)软件过滤、拼接、去除嵌合体后[22- 23],聚类为用于物种分类的 OTU(Operational Taxonomic Units),并将所有样品进行抽平。采用 RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析[24],置信度阈值为0.7,选用 Silva数据库[25],得到分类学信息。利用 Mothur 软件(Version 1.31.2)进行α多样性分析[26]。使用 Python 3.7 进行真菌功能类群 FUNGuild 数据库[27]比对。不同处理方差分析(ANOVA)、多重比较(Duncan′s test)及相关分析用SPSS 20.0软件完成。采用CANOCO 4.0软件对丰度前十的真菌门优势群落与土壤环境指标间的相互关系进行冗余分析,并采用Monte Carlo置换检验计算因子的重要性,其中置换次数设为999次,显著性水平为P<0.05[28]。

2 结果与分析

2.1 土壤性质

由表2可知,除CA外,不同轮作休耕模式对SMBC、SMBN、UA、APA、DA、OM及pH值均有显著影响(P<0.05)。其中SMBC含量T1、T3、T5、T7处理显著小于CK,其他处理均显著大于CK；SMBN含量T3、T6、T7处理显著低于CK,其余处理均显著高于CK；UA 活性T4处理显著小于CK,T6处理显著大于CK,其余处理与CK差异不显著；APA活性T1、T3处理与CK差异不显著,其余处理均显著高于CK；DA活性T2、T4、T8处理显著高于CK,其余处理与CK差异不显著；OM含量各处理均显著大于CK,且以T6处理最大,为14.35 g/kg；pH值T1、T6、T7处理与CK差异不显著,其余处理均显著低于CK。

表2 不同轮作休耕模式下土壤生物学性质Table 2 Soil biological properties under different fallow rotation modes

2.2 土壤真菌多样性

由表3可知,各处理文库的覆盖度均在99%以上,并结合样品稀释曲线均趋于平缓,说明本研究测序数据合理,能够准确反映出土壤真菌群落的真实信息(图1)。方差分析结果表明,T2、T3、T4、T7处理的OTUs数与CK差异不显著,其余处理均显著小于CK(P<0.05)；Chao1和ACE指数T7处理显著高于CK(P<0.05),T5、T6、T8处理显著小于CK(P<0.05),其余处理与CK差异不显著；Simpson和Shannon-wiener指数T5、T6、T8处理显著小于CK(P<0.05),其余处理与CK差异不显著。如所有样品中共有OTUs数目为458个,并以丰富种为主,其中处理CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8中所特有的OTUs数目分别为149、155、155、169、110、70、93、118和64个(图1)。

图1 不同轮作休耕模式下土壤真菌DNA稀释曲线和花瓣图Fig.1 Soil fungi DNA rarefaction curves and flower diagrams under different fallow rotation modesCK, 连续休耕3年; T1, 残膜覆盖,即前茬地膜玉米收获后,除去秸秆,未去除残膜,连续休耕3年; T2, 伏天深耕,即每年三伏天深耕1次,连续休耕3年; T3, 第一年施牛羊粪(7500 kg/hm2)、深翻耕(30 cm)后连续休耕3年; T4, 第一年施牛羊粪(7500 kg/hm2)、深翻耕(30 cm)后连续3年种植豌豆并在盛花期翻压还田; T5, 第一年施牛羊粪(7500 kg/hm2)、深翻耕(30 cm)后连续3年种植豌豆(每kg种子拌根瘤菌粉8.5 g)并在盛花期翻压还田; T6, 第一年将上茬玉米秸秆粉碎还田(还田量7500 kg/hm2)、施牛羊粪(7500 kg/hm2)、深翻耕(30 cm)后连续休耕3年; T7, 第一年将上茬玉米秸秆粉碎还田(还田量7500 kg/hm2)、施牛羊粪(7500 kg/hm2)、深翻耕(30 cm)后连续3年种植毛苕子并在盛花期翻压还田; T8, 第一年将上茬玉米秸秆粉碎还田(还田量7500 kg/hm2)、施牛羊粪(7500 kg/hm2)、深翻耕(30 cm)后连续3年种植箭筈豌豆并在盛花期翻压还田

表3 不同轮作休耕模式下土壤真菌序列数、丰富度与多样性指数Table 3 Soil fungi sequence numbers statistics, richness and diversity index under different fallow rotation modes

2.3 土壤真菌群落分布2.3.1 门水平上的群落组成

图2显示,各处理真菌群落相对丰度前10的真菌门分别为：子囊菌门(Ascomycota)(8.15%—69.38%)、担子菌门(Basidiomycota)(2.56%—15.63%)、被孢霉门(Mortierellomycota)(2.01%—7.76%)、壶菌门(Chytridiomycota)(0.18%—2.35%)、毛霉门(Mucoromycota)(0.09%—1.21%)、球囊菌门(Glomeromycota)(0.06%—0.36%)、隐真菌门(Rozellomycota)(0.01%—0.06%)、隐孢子菌(Aphelidiomycota)(0.00%—0.04%)、捕虫霉门(Zoopagomycota)(0.00%—0.02%)、梳霉门(Kickxellomycota)(0.00%—0.01%),共占真菌总数的15.77%—76.67%。其中子囊菌门、担子菌门和被孢霉门占真菌总数的15.21%—75.73%,说明这3个门的真菌为优势菌群。除隐真菌门、隐孢子菌、捕虫霉门、梳霉门外,不同处理真菌在门分类水平上,相对丰度有一定的差异。其中子囊菌门T2、T6处理显著高于CK(P<0.05)且以T6处理最大,T5、T8处理显著低于CK(P<0.05),其他处理与CK 无明显差异；担子菌门T1处理显著大于CK(P<0.05),其他处理与CK差异不显著；被孢霉门T1、T3、T4、T7处理与CK差异不显著,其他处理均显著低于CK(P<0.05)；壶菌门和球囊菌门T4处理显著高于CK(P<0.05),其他处理与CK差异不显著；毛霉门T2、T3、T4处理与CK差异不显著,其他处理均显著低于CK(P<0.05)。

2.3.2纲水平上的群落组成

图2所示,各处理真菌群落相对丰度前10的真菌纲分别为： 座囊菌纲(Dothideomycetes)(1.27%—60.69%)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)(4.11%—24.79%)、伞菌纲(Agaricomycetes)(1.75%—9.34%)、被孢霉纲(Mortierellomycetes)(2.00%—7.74%)、酵母菌纲(Saccharomycetes)(0.00%—2.59%)、壶菌纲(Chytridiomycetes)(0.03%—1.69%)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)(0.26%—2.94%)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)(0.19%—1.22%)、盘菌纲(Pezizomycetes)(0.23%—1.32%)、银耳纲(Tremellomycetes)(0.21%—1.35%),其他类群的相对丰度占25.33%—87.92%。其中座囊菌纲、粪壳菌纲、伞菌纲和被孢霉纲占真菌总数的10.53%—72.96%,说明这4个纲为优势菌纲。除锤舌菌纲外,真菌在纲分类水平上,各处理相对丰度有一定的差异。其中伞菌纲、壶菌纲、座囊菌纲分别T1、T4、T6处理显著高于CK(P<0.05),其他处理与CK差异均不显著；粪壳菌纲T5、T6、T8处理显著低于CK(P<0.05),其他处理与CK差异不显著；被孢霉纲T2、T5、T6、T8处理显著低于CK(P<0.05),其他处理与CK差异不显著；散囊菌纲T2处理显著大于CK(P<0.05),T1、T5、T6、T7、T8处理显著小于CK(P<0.05),其他处理与CK差异不显著；盘菌纲各处理与CK差异均不显著,但T3、T7处理显著大于T6、T8处理(P<0.05)；银耳纲T5、T6、T8处理显著小于CK(P<0.05),其他处理与CK差异不显著。

图2 不同轮作休耕模式下土壤真菌群落门分类水平下的相对丰度/纲分类水平下的相对丰度Fig.2 Relative abundance of soil fungi community at phylum and class levels under different fallow rotation modes

2.3.3不同物种组成

由表4 可知,20 种优势种绝大部分属于子囊菌门。不同轮作休耕模式在土壤真菌种水平下有差异：CK和T3处理以Mortierella_alpina和Gibberella_intricans为主,其相对丰度分别为3.6%和4.9%,5.3%和4.3%；T1处理以Plectosphaerella_cucumerina、Mortierella_alpina和Fusarium_oxysporum为主,其相对丰度分别为6.6%、5.3%和4.7%；T2处理以Gibberella_intricans、Gibberella_baccata和Aspergillus_niger为主要物种,相对丰度分别为3.2%、3.2%、2.7%；T4、T5处理以Mortierella_alpina为主,相对丰度分别为5.3%、1.3%；T6处理以Polythrincium_trifolii为主,相对丰度为59.3%；T7处理以Mortierella_alpina和Gibberella_intricans为主,相对丰度分别为4.0%、5.7%；T8处理以Gibberella_intricans为主,相对丰度为3.2%。

表4 不同轮作休耕模式下土壤真菌20种优势种的相对丰度/%Table 4 The abundance of top 20 species of soil fungi (%) under different fallow rotation modes

2.4 土壤真菌功能类群

采用FUNGuild预测不同处理土壤真菌群落的营养型,由图3可知,本研究以病理营养型(Pathotroph)、腐生营养型(Saprotroph)、共生营养型(Symbiotroph)及其他无法鉴定营养型的种群为主。其中T6处理以腐生营养型为主,相对丰度为62.9%,说明秸秆还田后深耕有利于腐生营养型真菌的生长；其余处理均以病理营养型和腐生营养型为主,除T4和T5处理外,CK、T1、T2、T3、T7、T8处理病理营养型的相对丰度均大于腐生营养型。

图3 不同轮作休耕模式土壤真菌功能分类与相对丰度Fig.3 Functional groups and relative abundance from soils with different fallow rotation modes

对土壤化学、生物指标与真菌功能类群进行相关分析表明,病理营养型与APA、CA、OM呈显著负相关(P<0.05),相关系数分别为-0.470、-0.445、-0.405。腐生营养型与CA、OM呈极显著正相关(P<0.01),相关系数分别为0.839、0.598；与UA呈显著正相关(P<0.05),相关系数为0.405。病理营养型与共生营养型显著正相关(P<0.05),相关系数为0.388。

2.5 相关分析与冗余分析

土壤生物学指标相关分析表明,SMBC与SMBN、DA呈极显著正相关(P<0.01),相关系数分别为0.543、0.869；与APA呈显著正相关(P<0.05),相关系数为0.408；与pH呈显著负相关(P<0.05),相关系数为-0.452。SMBN与DA呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.490。APA与DA、CA呈显著正相关(P<0.05),相关系数均为0.428。DA与pH呈显著负相关(P<0.05),相关系数为-0.475。CA与OM呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.702。

对土壤门真菌群落结构与环境因子进行RDA 分析(图4),真菌群落在两个排序轴上的解释率分别是71.56%、4.67%。置换检验的结果显示(表5),SMBC、SMBN、pH、OM均为主导真菌群落变化的主要因子。

表5 土壤真菌群落结构影响因子的Monte Carlo 置换检验Table 5 Monte Carlo permutation test of influencing factors of soil fungal community structure

图4 真菌群落与土壤环境因子冗余分析Fig.4 The redundancy analysis (RDA) of soil biological properties and fungi phyla level

3 讨论

3.1 不同轮作休耕模式对土壤真菌群落组成的影响

土壤真菌优势类群受作物类型、栽培模式、耕作措施、施肥种类等因素的影响[11]。本研究表明,不同处理下土壤真菌主要门类为子囊菌门、担子菌门、被孢霉门,主要纲类为座囊菌纲、粪壳菌纲、伞菌纲、被孢霉纲,其中子囊菌的相对丰度可以占到8.15%—69.38%,T6处理以座囊菌纲为主,其余处理以粪壳菌纲为主,说明子囊菌为不同处理土壤真菌的优势菌门。这与黄土高原梯田不同种植类型[10]、黔北不同种植模式[29]、黄土高原不同保护耕作措施[30]对土壤真菌群落结构的研究结论相似。子囊菌门是土壤腐生真菌,易受到植物种类和秸秆残茬的强烈影响,其功能是分解木质化植被碎屑[31]。本研究中,子囊菌门T2、T6处理显著高于CK(P<0.05),因T2、T6处理每年进行深耕,扰动土壤,为子囊菌门真菌提供了适宜的土壤环境,使其更好地利用可降解的植被残茬,促进菌群的快速增长与繁殖[32]；T5、T8处理显著低于CK(P<0.05),这可能与种植作物类型有关,其根系分泌物影响了土壤真菌群落的组成。

不同处理间土壤真菌门、纲、种的相对丰度不同,本研究中SMBC、SMBN、pH、OM是主导土壤真菌群落结构产生变化的主要因子,这与代红翠等[33]报道不同耕作和秸秆还田下褐土真菌群落的主要影响因子为土壤有机碳相一致。土壤有机质是微生物的碳源和氮源,休耕、深耕、秸秆还田、绿肥还田和有机肥施用影响了作物残茬的分解过程,促进了土壤有机碳的累积,引起土壤真菌群落结构组成发生改变[34]；pH是影响真菌群落结构的主要理化性质,这与我国毛竹林[35]土壤中研究结果相同。此外,大多数真菌为植物病原菌,引起多种真菌病害。例如,子囊菌引起根腐、茎腐、果(穗)腐和枝枯等；座囊菌是我国主要的果树病菌,引起香蕉叶斑病,梨叶斑病,葡萄黑痘病等[36]。

3.2 不同轮作休耕模式对土壤真菌Alpha多样性的影响

在表征Alpha多样性时,常用 Chao1和Ace指数来估算微生物物种总数[37],Shannon和Simpson指数通常用于估算物种的丰富度和均匀度[38]。本研究表明,Chao1和ACE指数T7处理显著高于CK,说明T7处理会使真菌丰富度和多样性上升,土壤活力增强,肥力更高,营养元素的循环代谢更为高效,而T5、T6、T8处理的Simpson和Shannon-wiener指数均显著小于CK,这可能受施肥种类、秸秆还田、种植作物类型的综合影响[39]。

3.3 真菌功能分类对不同轮作休耕模式的响应

根据营养方式可将真菌分为病理营养型、腐生营养型和共生营养型3种类型。病理营养型真菌从宿主细胞获取营养来源,土壤中的病理营养型真菌对植物生长具有一定负面影响[40- 41]。本研究中,病理营养型真菌相对丰度为2.3%—14.5%,T2处理显著高于CK,其余处理均显著低于CK,说明施肥、秸秆还田、绿肥还田结合深耕均降低了土壤中病理营养型真菌生长。本研究结果显示腐生营养型真菌丰度与土壤OM呈极显著正相关,这与李秀璋[42]研究结论一致,腐生真菌汲取生长所需营养及氨基酸类物质,但与代红翠等[33]研究结论不一致,这可能是因为FUNGuild功能比对是基于已有文献和数据,仅在一定程度上解析了真菌的功能[40]。本研究中31.1%—93.0%的土壤真菌功能未被解析出来,复杂的土壤真菌群落功能仍有待深入研究。

4 结论

9种轮作休耕模式对黄土高原半干旱区土壤生物学性质、真菌丰度、多样性以及菌群组成均具有显著影响。与休耕、残膜覆盖、伏天深耕相比,施肥、秸秆还田、绿肥还田结合深耕均降低了土壤中病理营养型真菌的相对丰度,降低作物生长存在潜在的负面影响,有利于保持农田土壤生态系统健康。土壤微生物量碳、微生物量氮、pH和有机质含量是影响黄土高原半干旱区不同轮作休耕模式土壤真菌群落结构变化的重要因素。