循环miRNA与寻常型银屑病不同中医证候的相关性研究

李珺莹，聂振华，李隽，张俊，李芸芸，李悦，张理涛

（天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）

银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发免疫介导的慢性复发性、炎症性、系统性疾病[1]，中医称为“白疕”。其发病率逐年升高，病程迁延，一直是皮肤科研究的重点。目前中医治疗本病有较为公认的证候分类标准。众多中医皮肤科先辈总结出“从血论治”寻常型银屑病辨证论治经验，其中血热证、血瘀证、血燥证的证候分型方法得到广泛认可[2]，但证候的生物学基础一直没有完全阐明。已有研究表明miRNA可以作为多种疾病的潜在生物学标志物。本研究将miRNA引入银屑病中医证候研究，检测不同中医证型寻常型银屑病患者血浆miR-146a、miR-155、miR-326的表达水平，以探寻和银屑病证候相关的miRNA生物学标志物，为银屑病的早期诊断和中医分型提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床资料 寻常型银屑病患者均来源于2019年2月—2019年8月天津市中医药研究院附属医院皮肤科住院患者，其中血热证30例、血瘀证15例、血燥证15证。男44例，女16例。年龄22～65岁，平均47.4岁。病史2个月～36年，平均35.3个月。入组要求：1个月内未服用过中药、维A酸类药物、免疫抑制剂及糖皮质激素等药物，未进行过光疗治疗；无肿瘤、免疫缺陷、心血管病、痛风、自身免疫性疾病等系统性疾病。健康对照组30例，来源于本院健康管理中心体检正常人群。

1.1.2 诊断标准 寻常型银屑病诊断参照《中国银屑病诊疗指南》（2018简版）制定。皮疹为覆有银白色鳞屑性斑（块）丘疹，刮之有薄膜现象和Auspitz征阳性。

1.1.3 中医辨证分型标准 参照《中医病证诊断疗效标准》及《寻常型银屑病（白疕）中医药循证临床实践指南（2013版）》中银屑病血热、血瘀及血燥证辨证标准。（1）血热证：主症：①皮损鲜红；②新出皮疹不断增多或迅速扩大。次症：①心烦易怒；②小便黄；③舌质红或绛；④脉弦滑或数。（2）血瘀证：主症：①皮损暗红；②皮损肥厚浸润，经久不退。次症：①肌肤甲错，面色黧黑或唇甲青紫；②女性月经色暗，或夹有血块；③舌质紫暗或有瘀点、瘀斑；④脉涩或细缓。证候确定：具备全部主症和1项以上次症。（3）血燥证：主症：①皮损淡红；②鳞屑干燥。次症：①口干咽燥；②舌质淡，舌苔少或薄白；③脉细或细数。以上证候确定需具备全部主症和1项以上次症及由2名副主任医师职称以上医生确定。

1.3 血浆miRNA检测方法

1.3.1 总RNA提取 各组研究对象均在清晨空腹自肘静脉以EDTA-k2抗凝管采集5 mL静脉血，2 h内离心（5 000转/min，4℃，10 min）分离血浆，分装于1.5 mL EP管于-80℃冰箱冻存备用。应用Trizol试剂（购自美国Norgen公司）提取样本血浆中的RNA，血浆miRNA提取根据miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒（DP503）操作指南进行。

1.3.2 实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测 采用HaiGene公司一步法miRNA反转录试剂盒，基于Peter改良的miR-Q技术完成反转录程序（新海基因D1801试剂盒）。Real-time PCR采用25 μL反应体系，SYBR Green PCR混合液为康为世纪产品，反应体系为：12.5 μL SYBR Mix，1 μL cDNA，上下游引物各 1 μL，ddH2O 体积 9.5 μL，合计 25 μL。仪器为ABIStep-plus系统。

主要试剂和仪器：TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒（TIANScript RT kit）及2×TapPCRMasterMix购于天根生化科技有限公司，PCR仪购于ABI公司，引物由天津迪恩生物技术有限公司设计合成。

1.3.3 miRNA表达水平计算 以健康组作为对照，miRNA以U6作为内参。miRNA表达Ct值（反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，其值越大，即表达量越低）：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt试验组-ΔCt对照组，采用 2-ΔΔCt表达量法计算miRNA的相对表达量。

1.4 统计学方法 应用SPSS23.0软件，计量资料数值以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采取ANOVA检验，计数资料以百分率表示，采取χ2检验。应用Pearson分析血浆miRNA表达量与银屑病皮损面积与严重程度指数（PASI）评分的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 循环血浆miR-146a、miR-155在不同证型寻常型银屑病患者中的表达水平均升高，且与疾病的严重程度呈正相关，与健康对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。循环miR-326在寻常型银屑病患者中的表达水平降低，与健康对照相比差异有统计学意义，见表 1～3。

2.2 3种不同证型间比较，银屑病血热证较血瘀证和血燥证患者循环血浆miR-146a、miR-155相对表达量显著升高；血燥型银屑病患者循环血浆miR-326的表达量明显降低；组间比较差异有统计学意义，见表 1～3。

表1 各组血浆miR-146a表达水平比较 （±s）

表1 各组血浆miR-146a表达水平比较 （±s）

注：与健康对照组同项目比较，*P<0.05；与血热型同项目比较，△P<0.05。

组别 n miR-146aCt 2-ΔΔCt PASI血热证 30 28.88±1.14 58.49±11.70*△ 22.12±2.13血瘀证 15 30.65±0.55 17.39±1.21*△ 20.53±1.76血燥证 15 31.81±1.07 7.73±0.90*△ 8.36±1.34健康对照 30 34.76±1.82

表2 各组血浆miR-155表达水平比较 （±s）

表2 各组血浆miR-155表达水平比较 （±s）

注：与健康对照组同项目比较，*P<0.05；与血热型同项目比较，△P<0.05。

组别 n miRNA-155Ct 2-ΔΔCt PASI评分血热证 30 28.12±1.18 41.36±6.06*△ 22.12±2.13血瘀证 15 30.20±1.32 9.92±0.99*△ 20.53±1.76血燥证 15 31.93±1.34 3.01±0.31* 8.36±1.34健康对照 30 33.51±1.58

表3 各组血浆miR-326表达水平比较 （±s）

表3 各组血浆miR-326表达水平比较 （±s）

注：与健康对照组同项目比较，*P<0.05；与血热型同项目比较，△P<0.05。

组别 n miRNA-326Ct 2-ΔΔCt血热证 30 21.66±0.84 1.45±0.11血瘀证 15 22.99±0.52 3.66±0.23血燥证 15 23.86±0.80 6.68±0.68*△健康对照 30 21.12±0.41

3 讨论

miRNA是一类长度约22 nt的非编码RNA，通过抑制特异性mRNA靶标而介导基因转录后调控。miRNA在进化上有极高的保守性、时序性、组织特异性及稳定性等特点。miRNA可以稳定释放到血液、体液循环中，即循环miRNA，其可介导全身细胞和组织之间的交流，其在血液体液中稳定存在并易于获取[3]。近年来，已有研究表明在肿瘤、心血管等多种疾病的血液及体液中可检测不同表达水平的循环miRNA，使得循环miRNA有望成为疾病诊断和治疗的潜在生物标志物[4]。目前已有报道多个miRNA在银屑病皮损或外周血单核细胞中异常表达[5]，但血浆miRNA在银屑病患者中的表达变化报道极少。

证候研究一直是中医研究的重点和热点。中医对银屑病有着独特的见解和良好的疗效，其中血热证、血瘀证、血燥证的证候分型方法得到广泛认可，实践证明是有效的，但证候的生物学基础一直没有完全阐明。证候是有其本质的，辨证是有一定分子生物学基础的，在基因组水平，特别是后基因组上可能存在结合点。基因表达的改变导致了病理变化，而证候则是某一阶段病理变化表现于外的综合描述。miRNA作为系统生物学中功能基因组学一部分，具有时序性、整体性等特点，与中医证候学的整体观念、恒动观不谋而合。由于miRNA及其调控紊乱在不同时空条件下的差异，使得不同的靶基因产生各自的异常蛋白，表现在宏观层次则出现不同的症状和体征，即不同的证候。现有研究证实，银屑病的发生发展与miRNA表达异常引起相应调控网络的紊乱密切相关，miRNA的表达水平和银屑病临床上表现的症状和体征存在密切的内在联系[6]。因此采用miRNA研究银屑病中医证候，其相关性可能更高。

目前研究表明，miR-146a在银屑病皮损表皮和真皮以及外周血单核细胞中表达升高且特异性表达于调节性T细胞（Treg细胞），并与细胞因子白细胞介素（IL）-17密切相关。且miR-146a通过IRAK1，TRAF6，EGFR等靶点调控肿瘤坏死因子（TNF）通路和天然免疫反应，对银屑病的发生、发展起到调节作用[5]。miR-155已被证实在固有免疫和适应性免疫过程中，包括各类T细胞分化、抗原提呈、炎症介导、细胞因子产生等生物过程中有着重要作用。而且与Th17细胞关系尤为密切。研究表明银屑病皮损中miR-155的表达上调，与细胞增殖等多种过程关系密切。miR-155通过靶向SOCS1和PTEN促进了银屑病皮肤炎性反应的维持。此外研究发现miR-155在银屑病皮损中表达增高，通过抑制其靶基因CTLA-4的表达可促进新生血管的生成和介导炎性反应而参与银屑病的发病[5]。

本研究发现血浆miR-146a、miR-155在不同证型寻常型银屑病患者中的表达水平均升高，且与疾病的严重程度呈正相关，这与以往研究二者在银屑病皮损的表达情况一致，提示miR-146a、miR-155和银屑病的发病及病情严重程度密切相关；血浆循环miR-146a、miR-155可能是寻常型银屑病的潜在生物学标志物，有望为银屑病的早期诊断和病情判定提供新的靶点。同时本研究发现与其他证型相比，血热型银屑病患者血浆中miR-146a、miR-155的相对表达量有显著性差异，尤其是miR-146a的相对表达量明显升高，提示其可作为银屑病中医辨证分型的潜在客观指标，有一定临床意义。

近年来miR-326在自身免疫性疾病中的作用逐渐受到关注，其在多发性硬化、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中均有异常表达。研究发现miR-326可促进Th17细胞分化，从而参与多种免疫相关性疾病的发生发展，并与疾病的严重程度呈正相关。Th17细胞也与银屑病的发病密切相关，但miR-326与银屑病的相关性极少有报道[7]。

本研究发现血浆miR-326在寻常型银屑病患者中的表达水平有降低趋势，虽然与健康对照相比差异无统计学意义，但miR-326在不同证型银屑病间的相对表达水平还是有所差异，尤其在血燥型银屑病中miR-326的相对表达量明显减少，提示miR-326在银屑病的发病尤其是病情的维持期发挥了一定作用，并可作为银屑病临床辨证分型的潜在客观指标。同时也提示笔者银屑病的免疫发病机制及其复杂，在病情的进展期和稳定期可能存在不同的免疫通路和作用机制，值得笔者进一步研究。