白细胞介素-17在Notch通路中对银屑病小鼠模型的作用

罗辉，邓玲俐，蒋亚辉，杨和荣

（四川省遂宁市中心医院，四川 遂宁 629000）

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，其发生发展与免疫功能失调、血管损伤、信号转导通路紊乱及银屑病相关基因表达失衡密切相关[1-3]。咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型造模方法简易，与人的银屑病发病机制相似，是国内外公认并普遍使用的理想模型[4-6]。白细胞介素（IL）-17细胞因子家族中IL-17A、IL-17C和IL-17F与银屑病的发生密切相关[7-8]，银屑病患者研究观察中，发现Notch蛋白家族Notch1-4、Jagged1-2以及DLL1、3、4在银屑病患者皮损中表达增强，可能参与了银屑病的发病机制[9]。为了探索IL-17在Notch通路对银屑病的影响作用，本研究建立咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型，腹腔注射重组人源IL-17a对模型小鼠机体进行刺激，观察IL-17蛋白和Notch mRNA表达水平，进一步了解银屑病的可能发病机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 重组人源IL-17a（上海西唐生物科技有限公司），戊巴比妥钠（上海试剂二厂生产），咪喹莫特（英国3M Health Care Limited公司），凡士林软膏（广州明露医疗卫生用品有限公司）。酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒及检测仪（美国CST公司），总RNA提取试剂盒、实时荧光定量（RT-PCR）试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。RT-PCR检测仪（瑞士Roche公司）。

1.2 实验动物分组 选取8周龄的雌性昆明小白鼠（SPF级）30只，体质量为 18～22 g，购自济南金丰实验动物有限公司[许可证号：SCXX（沪）2011-00241]。随机分为空白组、对照组和实验组，每组10只。此次实验使用的小白鼠取得了实验动物伦理委员会的批准。

1.3 银屑病小鼠模型的建立 腹腔注射戊巴比妥钠对所有小鼠进行麻醉，麻醉显效后，用剃毛器剃光小鼠背部面积约为2 cm×3 cm的背部毛，动作要轻柔，避免刮伤小鼠皮肤。空白组小鼠剃毛部位外涂凡士林软膏，对照组和实验组小鼠剃毛部位外涂咪喹莫特软膏，建立咪喹莫特诱导的银屑病模型，涂药后局部按摩30～60次，1次/d，连续用药10 d。同时，实验组每日腹腔注射100 ng/mL重组人源IL-17a进行刺激，空白组和对照组腹腔注射等体积生理盐水，10 d后取小鼠眶内血检测相关指标。

1.4 银屑病皮损评分 通过观察各组小鼠涂药部位的红班、鳞屑及浸润增厚的变化情况，按照国际银屑病皮损面积与严重程度指数（PASI）的评分标准对皮损评分，见表1。

1.5 指标观察 各组连续给药10 d后，取小鼠眼眶内血，离心后吸取上清液，制备出单个核细胞放置冰箱备用。严格按照试剂盒说明书进行实验操作：①利用ELISA检测IL-17蛋白含量；②利用RT-PCR法测定Notch mRNA表达水平；③利用Western blotting法检测 Notch1、Delta1、Delta4蛋白表达水平。

1.6 统计学处理 运用SPSS 22.0统计分析软件对数据进行处理，计量资料以±s表示且进行方差齐性检验，各组间比均数较采用两独立样本t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮损情况 空白组小鼠皮肤表面光滑，无斑块和鳞屑，偶见红斑。与空白组比较，对照组和实验组小鼠表皮可见银屑样改变，斑块隆起、可见红斑且表面覆盖有鱗屑，见图1。与对照组比较，实验组小鼠PASI指数高于对照组（P<0.05），表明了实验组小鼠皮损程度更严重，见表2。

表1 银屑病皮损评分标准

图1 小鼠皮损情况

表 2 PASI评分 （分，±s）

表 2 PASI评分 （分，±s）

组别 评分标准 组比 P空白组 0.20±0.42对照组5.90±0.57（1）∶（2）0.000实验组6.89±1.03（2）∶（3）0.027

2.2 各组小鼠外周血IL-17及单核细胞Notch mRNA表达水平 与空白组比较，对照组小鼠外周血IL-17蛋白与及单核细胞Notch mRNA表达水平显著上升（P<0.01）；与对照组比较，实验组小鼠外周血IL-17蛋白及单核细胞Notch mRNA表达水平升高（P<0.05），见表 3，图 2、3。

2.3 各组小鼠 Notch通路中 Notch1、Delta1和Delta4蛋白表达水平 通过Western Blot检测发现，见图4，与空白组比较，对照组Notch1和Delta4蛋白表达水平升高（P<0.05）；与对照组比较，实验组Notch1和Delta4蛋白表达水平上升表达水平升高（P<0.05），见表4、图5，3组Delta1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组小鼠外周血IL-17蛋白、单核细胞Notch mRNA水平比较 （±s）

表3 各组小鼠外周血IL-17蛋白、单核细胞Notch mRNA水平比较 （±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

组别 IL-17（μg/mL） Notch mRNA空白组 61.44±5.53 0.253±0.092对照组 106.27±4.37* 0.430±0.069*实验组 112.64±7.89# 0.491±0.047#F 12.546 2.335 P 0.001 0.002

图2 各组小鼠外周血IL-17蛋白表达水平

图3 各组小鼠外周血单核细胞Notch mRNA表达水平

图4 Western Blot检测蛋白表达结果

表4 Notch通路中相关蛋白相对含量表达水平比较 （±s）

表4 Notch通路中相关蛋白相对含量表达水平比较 （±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

组别 N o t c h 1/β-a c t i n D e l t a 1/β-a c t i n D e l t a 4/β-a c t i n空白组 0.1 9 9 9±0.0 3 3 9 0.2 8 9 7±0.0 5 7 8 0.1 3 3 5±0.0 4 0 0对照组 0.2 3 9 0±0.0 4 7 8* 0.2 6 8 8±0.0 4 0 6 0.2 0 0 2±0.0 4 1 7*实验组 0.3 6 4 7±0.0 5 0 5# 0.2 7 0 4±0.0 4 6 3 0.2 5 9 5±0.0 3 3 8#F 8.7 7 9 1 1.2 6 8 1 0.3 2 4 P 0.0 0 2 0.0 0 1 0.0 0 3

图5 各组小鼠Notch通路中Notch1、Delta1和Delta4蛋白表达水平

3 讨论

3.1 实验动物模型评价 此次实验利用咪喹莫特诱导小鼠建立银屑病模型中，小鼠表皮表现为角化不全及角化过度情况，表皮有乳头瘤样增生，应用抗银屑病药物治疗有一定的疗效，符合Di Meglio等[10]提出的理想银屑病动物模型。

3.2 实验结果评价 Notch通路是细胞之间相互作用的信号通路，能调控细胞分化、增殖、凋亡等过程[11]。有实验证实，Notch信号通路异常活化与肿瘤的发生发展密切相关，如胃癌患者研究中Notch通路异常活化[12]。银屑病研究中，发现Notch信号通路的激活与银屑病发病相关，可能的作用机制为Notch通路激活，促进角质形成细胞增殖、抑制细胞凋亡与分化[13]。细胞之间Notch配体与受体相互作用可产生 Notch信号，Notch1、Delta1和 Delta4作为 Notch通路主要受体和配体，Notch1、Delta1和Delta4蛋白的表达量与Notch通路活化程度相关。IL-17是免疫细胞产生的一种炎性因子，诱导和调节机体的多种免疫应答反应，在类风湿、湿疹等自身免疫性疾病发病机制中有着重要影响作用[14-15]，与自身免疫的调节密切相关。银屑病也是机体自身免疫的调节紊乱导致的自身免疫性疾病，与IL-17过表达存在一定的联系，乔菊等[16]在检测银屑病患者IL-17表达水平研究中证实了这一点，研究发现银屑病患者IL-17表达水平高于正常人。本研究通过建立银屑病小鼠模型，观察IL-17和Notch信号通路相关蛋白的表达量，进一步证实他们之间的联系。实验发现，模型小鼠外周血炎性因子IL-17、Notch mRNA和Notch通路相关蛋白表达水平上升，表明了银屑病小鼠发病与IL-17和Notch通路的表达存在一定的关联性。可以推测，小鼠表皮在咪喹莫特诱导诱导下形成类似银屑病病体征，同时机体对外界刺激作出反应，T细胞大量分泌IL-17介导免疫反应，Notch信号通路被激活促进炎性细胞增殖。为了增加实验的可比性，笔者用重组IL-17a刺激银屑病小鼠模型后发现，上调IL-17表达水平小鼠外周血IL-17、单核细胞Notch mRNA以及Notch通路相关蛋白的表达水平上升，小鼠表皮银屑病特征表现更为严重，进一步证实了IL-17与Notch上调加重银屑病发展。总而言之，当机体受到刺激后，T细胞大量表达炎性因子IL-17，同时Notch信号通路被激活，IL-17与Notch通路的相互作用加重银屑病的发生发展。

银屑病是皮肤科较为常见疾病，传统治疗方法效果并不理想，因而给患者的健康和生活带来很大的困扰。从分子学角度去研究银屑病，更深入的了解其发病机制，对开发相关治疗药物至关重要。