乙肝肝硬化肠道菌群变化与肝功能Child-Pugh分级、LPS及血氨的相关性

张良杰，李 伟，陈家盛，刘传苗，赵守松

(蚌埠医学院第一附属医院感染科，安徽 蚌埠 233000)

肝硬化是我国常见的慢性进行性肝病，最主要病因是乙型肝炎病毒感染，可导致肝功能损害、内毒素血症、消化道出血、腹水、肝性脑病等，并成为患者预后的重要影响因素[1]。近年来关于乙肝肝硬化机制的研究较多，已明确内毒素(LPS)可引起肝脏炎症反应，促进肝纤维化增生，加重肝硬化[2]；血氨在肝硬化患者中水平高于正常人群，其与肝硬化患者肝功能损害程度有关[3-4]。但长期临床工作经验发现，LPS、血氨无明显异常的乙肝患者，仍会发生肝功能损害与肝硬化，提示有其他机制参与了肝功能的恶化。肠道菌群是定植于人体最大的微生态系统，正常情况下肠黏膜有很多益生菌，共同维持内环境稳态，并参与机体免疫功能的调节[5-6]。研究发现，乙肝肝硬化患者与正常人群相比，存在肠道菌群变化，但与乙肝患者肠道菌群对比的报道较少，且肠道菌群变化是否与肝功能、LPS及血氨有关仍有待探讨[7]。鉴于这种情况，本研究选取乙肝肝硬化及单纯乙肝患者作为研究对象，探讨乙肝肝硬化肠道菌群变化与肝功能Child-Pugh分级、LPS及血氨之间的相关性，为深入了解肝硬化发生机制、肝硬化及其并发症的防治提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年1月至2020年1月间，蚌埠医学院第一附属医院感染科收治的80例乙肝肝硬化患者(肝硬化组)、80例单纯乙肝患者(乙肝组)及体检中心80例健康人群(对照组)。纳入标准：乙肝组及肝硬化组病例分别符合我国《慢性乙型肝炎防治指南2019年版》及《肝硬化诊治指南》诊断标准[8-9]；入组前3个月未接受过微生态制剂和抗生素治疗。排除标准：合并乙肝病毒外其他嗜肝病毒感染者；药物性肝炎者；酒精性肝炎者；自身免疫性肝炎者；遗传代谢性肝病等慢性肝脏疾病；存在肝癌等恶性肿瘤者；精神病患者；胃肠道大手术史；炎症性肠病患者。该项研究征得研究对象的知情同意，并通过了我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集患者的性别、年龄、身体质量指数(Body mass index，BMI)、饮酒史、合并疾病、近期用药史等资料。

1.2.2 肠道菌群、LPS、血氨检测 (1)肠道菌群检测：在患者入院后，收集新鲜粪便标本，0.5 h内送检，挑取中心部位粪便样本进行检测，或留取新鲜粪便标本保存条件为-80 ℃冰箱冻存，择期统一检测。使用QIAamp DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)提取粪便DNA，严格按照说明书进行操作，以提取的DNA为模板，使用带Barcode的特异引物，338F(5’-GTACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3’)和806R(5’-GTGGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3’)与高效高保真酶(新西兰Biolabs公司)进行PCR反应，应用测序仪(美国Pacific Biosciences)进行测序，应用Uparse软件进行聚类分析，采用Mothur方法进行物种注释，采用Version 2.15.3 R软件进行多样性分析，记录肠道各菌群的拷贝数、衡量菌群丰度的Chao指数、衡量群落多样性的Shannon指数。(2)在患者入院后次日采集清晨外周静脉血5 mL，采用鲎试剂比浊法试剂盒检测(厦门市鲎试剂实验厂)血浆LPS水平，采用血氨测定仪(日本京都AMMONIA测定仪(日本京都Ⅱ型)检测血氨水平，为避免血氨检测时间带来的误差，血氨检测均于采集血标本后立刻送检。

1.2.3 肝功能Child-Pugh分级 包括临床生化指标、HE、腹水、总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间延长，A级：5～6分,B级：7～9分,C级：≥10分。HE的诊断参考《肝硬化肝性脑病诊疗指南》[10]。

1.3 观察指标(1)对比三组临床资料，包括患者的年龄、性别、BMI、饮酒史和合并以下疾病情况，高脂血症、糖尿病、心脏病、高血压。(2)比较三组肠道菌群变化。(3)比较三组研究对象肠道菌群丰度和多样性Chao指数、Shannon指数、LPS、血氨有无统计学差异。(4)分析肠道菌群丰度和多样性Chao指数、Shannon指数与肝功能Child-Pugh分级、LPS、血氨相关性。(5)在肝硬化组内比较有无HE患者肠道菌群丰度和多样性Chao指数、Shannon指数、LPS、血氨指标的差异。(6)分析肠道菌群丰度和多样性、LPS、血氨诊断HE的效能。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0处理数据，计数资料以频数和构成比n(%)表示，行卡方检验，计量资料采取Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态布，以“均数±标准差”表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用LSD-t检验，两组间比较采用独立样本t检验。采用Pearson相关分析肠道菌群丰度和多样性与LPS、血氨相关性；采用Spearman秩相关分析肝功能Child-Pugh分级与肠道菌群丰度和多样性相关性。采用ROC及AUC获取各指标诊断HE的置信区间、敏感度、特异度及cut-off值，联合诊断实施二元logistic回归拟合，返回预测概率logit(P)，将其作为独立检验变量，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较三组年龄20～68岁，肝硬化组平均年龄为(40.04±9.95)岁，乙肝组平均年龄为(39.51±9.68)岁，对照组平均年龄(38.97±9.42)岁，三组年龄无显著性差异。肝硬化组、乙肝组、对照组BMI分别为(22.37±2.16)、(22.43±2.07)和(22.34±2.13)，三组BMI差异无统计学意义。组间性别、饮酒史、合并疾病等资料均衡，具有可比性(P>0.05)，见表1。

表1 三组临床资料对比[n(%)]

2.2 三组肠道菌群变化比较乙肝组、对照组拟杆菌门、厚壁菌门是肠道菌群的绝对优势菌，在肠道菌群中占比之和>80%，乙肝组、对照组组间拟杆菌门、厚壁菌门占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。肝硬化组拟杆菌门、厚壁菌门占比低于乙肝组、对照组(P<0.05)。变形菌门、梭杆菌门占比：肝硬化组>乙肝组>对照组(P<0.05)。放线菌门、疣微菌门、蓝菌门在肝硬化组、乙肝组及对照组间无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 三组肠道菌群变化比较

2.3 三组肠道菌群丰度和多样性、LPS、血氨比较Chao指数、LPS：肝硬化组<乙肝组<对照组，Shannon指数、血氨：肝硬化组<乙肝组、对照组(P<0.05)。Shannon指数、血氨在乙肝组、对照组间无显著差异(P>0.05)，见表3。

表3 三组肠道菌群丰度和多样性、LPS、血氨比较

2.4 肠道菌群丰度和多样性与肝功能Child-Pugh分级、LPS、血氨相关性肝硬化组Child-Pugh分级A级30例、B级32例、C级18例。Chao指数与Child-Pugh分级(r=-0.594，P<0.001)、LPS(r=-0.694，P<0.001)、血氨(r=-0.606，P<0.001)呈负相关，Shannon指数与Child-Pugh分级(r=-0.529，P<0.001)、LPS(r=-0.663，P<0.001)、血氨(r=-0.850，P<0.001)呈负相关，见图1。

图1 肠道菌群丰度和多样性与肝功能Child-Pugh分级、LPS、血氨相关性

2.5 肝硬化组有无HE患者肠道菌群丰度和多样性、LPS、血氨比较肝硬化组患者根据有无HE分为HE患者和无HE患者，HE患者Chao指数、Shannon指数低于无HE患者，LPS、血氨高于无HE患者(P<0.05)，见表4。

表4 癌组织P-ERK1/2蛋白磷酸化与临床病理相关性

2.6 肠道菌群丰度和多样性、LPS、血氨诊断HE的效能各指标联合诊断HE的AUC最高，为0.891，其次是血氨(0.825)，见表5、图2。

表5 ROC分析结果

3 讨论

3.1 乙肝肝硬化肠道菌群变化本研究发现，变形菌门、梭杆菌门占比：肝硬化组>乙肝组>对照组，Chao指数肝硬化组<乙肝组<对照组，Shannon指数肝硬化组<乙肝组、对照组，提示乙肝和肝硬化均可引起肠道菌群变化，而单纯乙肝患者肠道菌群的绝对优势菌占比与正常人群相似，进展至肝硬化后，绝对优势菌占比明显降低，说明肝硬化导致肠道菌群变化更明显，随着病情加重，肠道菌群丰度和多样性均降低。有动物学实验显示，随着肝硬化的进展，模型大鼠与正常大鼠肠道菌群相似性明显降低，细菌易位率明显升高，佐证了肝硬化可造成肠道菌群的变化[11]。张磊等[12]报道，肝硬化患者厚壁菌门、拟杆菌门比例显著降低，本研究观点与之相似。乙肝肝硬化患者肝脏功能损伤后，可通过肠-肝轴，降低肠道的血供、减少胆汁分泌、影响肠道蠕动等，引起肠黏膜功能变化，且肝功能严重受损时，可介导肠黏膜氧化应激反应，减弱肠黏膜屏障功能，增加肠黏膜通透性，从而导致肠道菌群变化[13-14]。

图2 肠道菌群丰度和多样性、LPS、血氨诊断HE的效能

3.2 乙肝肝硬化肠道菌群变化与肝功能Child-Pugh分级、LPS的关系肝功能Child-Pugh分级是临床上常用的评估肝脏储备功能的指标，与乙肝肝硬化患者预后息息相关[15]。本研究显示，Chao指数、Shannon指数与Child-Pugh分级呈负相关，提示肠道菌群丰度和多样性可影响乙肝肝硬化患者肝功能。人类肝脏中3/4的血供来源于肠道的回流血，门静脉和肠系膜淋巴系统在解剖上的关联，使肝脏与肠道菌群在功能上存在密切联系，一方面肠道中食物抗原、细菌产物、环境毒素等能通过血液，运输至肝脏，破坏肝脏结构，导致肝功能受损，另一方面肝硬化患者因发生门脉高压，增加了肠黏膜通透性，结肠菌群、LPS等可通过肠壁淋巴系统与肠黏膜屏障，引起内毒素血症、细菌易位、腹膜炎等，导致肝硬化的恶化，故肠道菌群变化可影响患者肝功能分级[16-17]。乙肝肝硬化患者随着肝功能减退和门静脉高压加重，发生内毒素血症的风险逐渐增加，LPS不仅在促进肝纤维化中扮演重要角色，还与感染、肝腹水、HE等有关，因此明确内毒素血症发生机制至关重要[18]。本研究显示，Chao指数、Shannon指数与LPS呈负相关，说明肠道菌群丰度和多样性与LPS有关。LPS是革兰阴性菌细胞壁组成成分，可反映细菌生长情况，高水平LPS可导致肠源性内毒素血症的发生，因此肠道菌群异常可能是内毒素血症发生的一个机制。可见临床处理乙肝肝硬化患者时，除常规治疗外，还应重视肠道菌群的纠正，本研究结果为益生菌干预提供了有力依据。

3.3 乙肝肝硬化肠道菌群变化与血氨的关系及各指标诊断HE的价值机体氨来源于蛋白质的消化和谷氨酰胺的脱氨基过程，氨在肠道产生后，先进入门静脉[19]。若机体肝功能正常，可清除几乎所有肠道来源的氨，避免其进入外周循环，损害机体，因此血氨可反映机体肝功能状态[20-21]。本研究数据显示，Chao指数、Shannon指数与血氨呈负相关，说明肠道菌群可影响血氨水平，其机制可能是通过影响肝功能及蛋白质的消化实现的。HE是乙肝肝硬化患者常见的一种并发症和死因[22]。目前临床诊断HE多依据临床表现、肝功能生化指标、HE诱因病史、脑电图等进行综合诊断，诊断方法复杂，且易漏诊轻型HE。现阶段关于肠道菌群、LPS、血氨联合诊断HE的报道鲜见，本研究对此探讨发现，HE患者Chao指数、Shannon指数低于无HE患者，LPS、血氨高于无HE患者，提示以上参数可能与HE有关。因此后续进行了ROC分析，结果显示单一指标中血氨AUC最高，能为临床选取合适指标诊断HE提供参考，但仍低于各指标联合AUC的0.891，说明各指标联合能为临床提供更可靠的参考信息，从而指导临床后续的相关检查与干预。本研究不足之处在于，通过肠道菌群分析获得Chao指数、Shannon指数需进行多项操作，基层医院可能无法实施，导致研究结果应用范围缩小，有待后续的进一步探讨。

综上所述，乙肝肝硬化肠道菌群异常与肝功能Child-Pugh分级、LPS、血氨有关，肠道菌群可能参与了肝功能恶化、内毒素血症以及HE并发症的发生与病情进展，肠道菌群Chao指数、Shannon指数有助于HE的诊断，调节肠道菌群有望成为乙肝肝硬化患者治疗方案中的一部分。