基于罗丹明-高半胱氨酸荧光探针对Hg2+的检测

李爱玲， 赵秋媛， 王红斌， 周丽波， 张艳丽， 谭 伟*， 张丽珠

(1.云南民族大学化学与环境学院，云南昆明 650500； 2.云南民族大学民族医药学院，云南昆明 650500)

汞是一种被广泛使用的重金属，在日光灯、电脑、移动电话和日常电池等日常产品中，都不同程度的使用了含汞材料[1]。Hg2+具有高腐蚀性和致癌性，是常见的环境污染物之一[2]。人体内微量汞的累积不能通过自身的新陈代谢来排泄，这将直接导致心脏、肝脏和甲状腺疾病，导致神经系统崩溃，慢性汞中毒，甚至导致恶性肿瘤的形成[3]。由于它的持久性、可移植性和高生物浓缩性，其最终会对人体造成极大的伤害[4]。因此，建立一种简便、快速、灵敏的Hg2+检测方法具有重要的实用价值[5]。

目前，检测Hg2+的方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、发射光谱法(OES)、原子吸收光谱法(AAS)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等[6,7]。然而，这些方法都需要昂贵的仪器，复杂的样品前处理步骤等。荧光探针技术具有选择性专一，灵敏度高、速度快、操作简单等特点[8,9]。目前，有较多关于Hg2+荧光探针的报道[10]。罗丹明衍生物(Rh6G2)具有良好的光学稳定性、高荧光量子产率[11]等优点，其独特的螺环结构和荧光特性在金属离子探针的设计过程中起着重要的作用。在特定金属离子诱导下，罗丹明内酰胺环发生开环，并伴随着溶液由无色变为粉红色和荧光增强现象。基于Rh6G2荧光探针具有良好的光物理性质，广泛应用于医学、生物学、环境化学等领域[12，13]。

本课题组在前期的研究中发现探针Hcy-Rh6G2在Tris-HCl缓冲体系中对Cu2+有很好的识别效果，但对Hg2+响应较差[14]。基于此，本文进一步研究发现探针Hcy-Rh6G2在 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲体系中对Hg2+具有识别效果好的特性，据此建立了探针Hcy-Rh6G2对Hg2+的荧光测试方法，并利用探针Hcy-Rh6G2对昆明某河的实际水样进行了测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

5J1-004F-7000荧光分光光度计(日本，Hitachi)；MR Hei-Tec电磁加热搅拌器(广州得翔科技有限公司)；EF20 pH酸度计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

高半胱氨酸(Hcy)(>90%,生化试剂)、罗丹明6G(Rh6G)(95%,分析纯)、水合肼(80%,分析纯)、二氯甲烷、乙酸乙酯、NaH2PO4(分析纯)、Na2HPO4(分析纯)、Al2O3(分析纯)，均购自国药集团化学试剂有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(分析纯，Shanghai Mackin Biochemical)。

1.2 探针制备及荧光光谱测试

探针分子Hcy-Rh6G2按课题组前期报道的方法[14]合成。在甲醇和HEPES(1∶1)体系中，分别测定Hcy-Rh6G2和Hcy-Rh6G2+Hg2+两个体系的荧光光谱。荧光光谱测试条件为：激发波长510 nm，发射波长520 nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5 nm。

1.3 实际水样的检测

为了探究探针分子Hcy-Rh6G2对实际水样中Hg2+的检测，实验取昆明捞鱼河中的水样进行测定。在两个水样中分别加入浓度为0.12、0.2 mmol/L Hg2+，平行测定3次，计算回收率和相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 探针荧光光谱性能测试

在甲醇和HEPES(1∶1)体系中，将30 μL 0.1 mol/L Hg2+加入4 mL 0.1 mmol/L探针Hcy-Rh6G2溶液中。探针Hcy-Rh6G2和Hcy-Rh6G2+Hg2+体系荧光光谱测试结果如图1所示。由图1可见，Hcy-Rh6G2荧光较弱，加入Hg2+后，在最大吸收波长为553 nm处的荧光强度为24.17。表明加入Hg2+能导致探针Hcy-Rh6G2荧光增强，从而建立一种检测Hg2+的方法。

2.2 溶液pH对探针Hcy-Rh6G2荧光光谱的影响

为了探究pH对探针荧光强度的影响情况，用0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH溶液调节溶液pH，在甲醇和HEPES(1∶1)的体系中，将2 mL 0.1 mol/L Hcy-Rh6G2溶液加到不同pH(1.0～12.0)的溶液中。探针荧光强度随pH变化如图2所示。从图可以看出，在pH=6.2～12.0范围内，探针的荧光强度受pH的影响较小，当pH从6.2降至1.0时，探针的荧光强度随pH值减小而增强，说明探针在pH为6.2～12.0的范围内较为稳定，其荧光强度较低，具有较小的背景值。其可能的原因是探针分子内酰胺环在碱性条件下是较为稳定成闭环状态，在酸性较强的溶液中产生开环反应，进而产生较强的荧光。

图1 Hcy-Rh6G2和Hcy-Rh6G2+Hg2+的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of probe Hcy-Rh6G2 and probe Hcy-Rh6G2+Hg2+ [Hcy-Rh6G2]=1.0×10-4 mol/L,[Hg2+]=0.1 mol/L,pH=7.0.

图2 探针Hcy-Rh6G2的荧光强度与pH关系曲线Fig.2 Fluorescence intensity-pH curve of probe Hcy-Rh6G2

图3 不同金属离子对探针Hcy-Rh6G2荧光光谱的影响Fig.3 Effect of different metal ions on fluorescence spectra of probe Hcy-Rh6G2 [Hg2+]=0.1 mol/L,VCH3OH∶VHEPES=1∶1,pH=7.0.

2.3 探针Hcy-Rh6G2的选择性实验

为了进一步研究探针在HEPES体系中对Hg2+的选择性识别，分别将探针溶液加入到金属离子Na+、Ni2+、Fe2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、K+、Mn2+溶液中，测定其荧光强度。探针的离子选择性实验结果如图3所示。从图3可以看出，探针Hcy-Rh6G2对Hg2+的荧光响应最好，说明探针Hcy-Rh6G2对Hg2+具有较好的专一识别性能。

2.4 干扰实验

图4 (a)常见阳离子对Hg2+识别的干扰；(b)常见阴离子对Hg2+识别的干扰Fig.4 (a) Interference of common cations on Hg2+ recognition;(b) interference of common anions on Hg2+ recognition

2.5 分析性能

为了考察Hcy-Rh6G2探针对Hg2+浓度滴定的影响，当探针的浓度为1.0×10-4mol/L时，向其中加入不同浓度的Hg2+(0～7.50×10-4mol/L)，其荧光光谱如图5(a)所示。从图中可以看出，Hg2+浓度小于3.0×10-4mol/L时，荧光强度不断增强，Hg2+浓度大于3.0×10-4mol/L时，荧光强度趋于平缓。在波长555 nm处的荧光强度随Hg2+浓度增加的荧光曲线如图5(b)所示，Hg2+浓度在2.50×10-5～2.25×10-4mol/L范围内，荧光强度与Hg2+浓度呈线性关系，其回归方程为：y=1.6698x-5.4375，相关系数R=0.9799，检出限为6.19×10-6mol/L。

图5 (a)Hg2+浓度变化与探针Hcy-Rh6G2相互作用的荧光滴定曲线；(b)探针Hcy-Rh6G2的荧光强度随Hg2+浓度变化的线性关系图Fig.5 (a)Fluorometric titration curves of interaction between Hg2+ concentration and probe Hcy-Rh6G2；(b) Linear relationship between the fluorescence intensity of probe Hcy-Rh6G2 and the concentration of Hg2+

2.6 检测机理研究

为了探究探针Hcy-Rh6G2和Hg2+的反应机制，先将12 μL 0.1 mol/L Hg2+加入到探针溶液中反应24 h，再加入24 μL 0.1 mol/L EDTA，测定其荧光光谱，结果如图6(a)所示，探针识别Hg2+后可能存在的副产物质谱检测结果如图6(b)所示。从图6(a)可以看出，当加入对Hg2+络合较强的EDTA 后，未对其荧光产生明显影响，说明Hcy-Rh6G2对Hg2+的识别过程不可逆且结合较为紧密。检测反应产生的副产物的质谱分析(Q-TOF-MS)：([M+H])理论值：415.20m/z，实测值：415.2015m/z，判断产生了RCOOH，可能的原因是发生了水解反应。推断Hcy-Rh6G2探针对Hg2+的识别机理如图7所示。

图6 (a)过量EDTA浓度下Hcy-Rh6G2-Hg2+的荧光光谱；(b)Hcy-Rh6G2+Hg2+的质谱图Fig.6 (a) Fluorescence spectra of Hcy-Rh6G2-Hg2+ at excessive EDTA concentration([Hcy-Rh6G2] = 1.0×10-4 mol/L,[Hg2+]=0.1 mol/L)；(b)Mass spectrum of Hcy-Rh6G2+Hg2+

图7 探针Hcy-Rh6G2与Hg2+的反应机理Fig.7 Reaction mechanism of probe Hcy-Rh6G2 and Hg2+

2.7 实际水样分析

采用标准加入法研究探针对昆明捞鱼河水样中Hg2+的检测情况，结果如表1所示。Hg2+添加浓度范围为0.12～0.2 mmol/L，回收率为97.0%～98.9%，相对标准偏差(RSD)为0.34%～0.57%。分析结果可靠，可用于实际水样中Hg2+的检测。

表1 实际水样中Hg2+的测定结果(n=3)Table 1 Determination of Hg2+ in actual water samples(n=3)

3 结论

建立了一种利用探针Hcy-Rh6G2对Hg2+的荧光检测方法。研究结果表明，探针分子Hcy-Rh6G2可以在HEPES缓冲溶液中快速、选择性的识别Hg2+，当Hg2+浓度在2.50×10-5～2.25×10-4mol/L范围内，Hcy-Rh6G2荧光探针对Hg2+具有较好的线性关系。实验探究了探针对Hg2+检测机理，结果显示可能为水解反应。