基于金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极的同型半胱氨酸电化学传感

张靖芳， 郑 霄， 臧柳园， 郑冬云*,2,3

(1.中南民族大学生物医学工程学院，湖北武汉 430074;2.医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，湖北武汉 430074;3.脑认知科学实验室国家民委重点实验室，湖北武汉 430074)

同型半胱氨酸(2-氨基-4-巯基丁酸)是生物体内一种低分子量氨基硫醇，为人体必需的氨基酸，它不能通过食物摄入获得，而是蛋氨酸代谢过程中的中间产物。生物体内，同型半胱氨酸以二硫键的形式与半胱氨酸、还原型谷胱甘肽以及蛋白质交联。生物样品中同型半胱氨酸的总浓度指的是上述所有种类同型半胱氨酸浓度的总和，人体血浆内同型半胱氨酸总浓度的正常值通常在5.0～16.0 μmol/L之间[1]。而维生素B12、叶酸和磷酸吡哆醛的缺乏[2]，遗传因素，甲烯四氢叶酸还原酶[3](MTHFR)等的基因多态性，这些因素可造成同型半胱氨酸浓度升高，从而引发高同型半胱氨酸血症。研究证明，该疾病与老年认知障碍、缺血性心脑血管疾病、肺栓塞、外周血管疾病[4]、肿瘤、妊娠期胎儿不良、高血压[5]以及糖尿痛肾脏病变[6]等疾病的发生都有着密切的关系。因此，对同型半胱氨酸的快速、高灵敏、准确检测将可以为临床上相关疾病的诊断提供重要的辅助信息。目前已见报道的同型半胱氨酸检测方法包括以下几种：高效液相色谱(HPLC)[7]法、毛细管电泳(CE)法[8]、气相色谱法(GC)[9]、荧光光谱[10]法、免疫分析[11]法、分子印迹荧光传感[12]法以及电化学传感法。其中，电化学传感法因具有操作简单、成本低、灵敏度高、响应快速、易于微型化和自动化等特点而备受关注。因此，本研究拟采用电化学传感法，以实现对同型半胱氨酸的高灵敏、快速、准确的检测。

石墨烯是一种典型的二维碳纳米材料，具有独特的sp2杂化晶体结构和蜂窝结构，因分子中存在离域π键而拥有的大量离域电子，使其具有非凡的电子特性和电学性质。目前已被报道用于NO[13]、葡萄糖[14]、DNA[15]、抗坏血酸[16]、多巴胺[17]、蛋白质[18]以及L-半胱氨酸[19]等生物分子的电化学与生物传感检测。金纳米粒子由于其独特的化学、电子学和光学性能以及良好的生物相容性，被广泛应用于生物医学传感、肿瘤治疗、生物标记、重金属分析、化工催化等[20]领域。本文基于金纳米粒子-石墨烯复合膜构建了同型半胱氨酸电化学传感界面。一方面，借助于金纳米粒子和石墨烯作为纳米材料的大比表面积，增大修饰电极的有效面积，增加同型半胱氨酸在化学修饰电极表面的富集量，提高传感器的检测灵敏度；另一方面，金纳米粒子和石墨烯良好的导电性可促进同型半胱氨酸与化学修饰电极表面的电子转移速率，从而缩短传感器的响应时间；此外，金与同型半胱氨酸结构中的巯基有良好的亲和作用，可在一定程度上保证传感器的选择性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI 660D型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；pHS-3E酸度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；扫描电镜(SEM)及能量色散X射线(EDX)光谱表征在FEI-Sirion 200场发射扫描电子显微镜(FEI公司)上进行。

氧化石墨烯粉末(粒径1～10 μm，济宁利特纳米技术责任有限公司)，液体石蜡(化学纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)，D，L-高半胱氨酸(又称同型半胱氨酸，HcySH，纯度>90%，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)，HAuCl4·4H2O(上海化学试剂有限公司)。0.25 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)：称取50 g NaCl，1.25 g KCl，22.375 g Na2HPO4·12H2O，1.5 g KH2PO4溶于200 mL的超纯水，调节溶液的pH至7.0，定容至250 mL。实验所用其它试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

AB胶及铜丝购于本地五金建材超市。

1.2 石墨烯碳糊电极的制备

图1 石墨烯碳糊电极示意图Fig.1 Schemetic diagram of carbon paste electrode

石墨烯碳糊电极的制备：(1)将直径为500 μm的铜丝穿入尖端直径为200 μm的塑料管内，并用AB胶将铜丝和枪头尾端固定；(2)称取10 mg石墨烯粉末，并置于玛瑙研钵中与30 μL石蜡油混合，充分研磨制得石墨烯碳糊；(3)将石墨烯碳糊挤压进枪头尖端，并在称量纸上磨平，即制得石墨烯碳糊电极。如图1所示。

在使用之前，将所制得的石墨烯碳糊电极置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]及1 mol/L KCl溶液中，在-0.2～0.8 V电位范围内，以100 mV/s的扫描速率进行循环伏安扫描，以检查电极是否漏液，并确保所制备的石墨烯碳糊电极具有良好的重现性。

石墨烯碳糊电极的更新：将电极头端部分在无水乙醇中超声2 min，待电极头端空腔被清洗干净后，空气中晾干，重新填充新石墨烯碳糊。

1.3 金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极的制备

将检验合格的石墨烯碳糊电极置于5.0 mmol/L HAuCl4溶液中，在-1.5～0 V电位范围内[21]，以100 mV/s的扫描速率循环伏安扫描10圈，即制得金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极。

1.4 同型半胱氨酸的电化学检测

检测均采用三电极系统。其中，裸石墨烯碳糊电极或金纳米粒子-石墨烯碳糊电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极。检测底液为0.25 mol/L的PBS(pH=7.0)，扫描电位范围为-0.2 V～0.8 V，富集电位为-0.2 V，富集时间为40 s。

2 结果与讨论

2.1 不同电极的表面形貌表征及能谱分析

为探究金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极对同型半胱氨酸的电催化机理，借助于扫描电子显微镜技术对不同电极的表面形貌进行了表征，结果如图2所示。裸石墨烯碳糊电极的表面较平整(图2A)；电沉积金纳米粒子之后，电极表面变得较疏松，且可以观察到大量金纳米颗粒(图2B)。不管是电极表面的疏松结构，还是石墨烯和金纳米颗粒的纳米效应，都有利于增大电极的比表面积，提高传感器对同型半胱氨酸的有效富集，为传感器的高灵敏度提供良好基础。此外，金与同型半胱氨酸结构中的巯基具有良好的亲和作用，这一点可有效保证传感器对同型半胱氨酸检测的特异性。

图2 裸石墨烯碳糊电极(A)以及金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极(B)的扫描电镜(SEM)图Fig.2 SEM images of bare graphene carbon paste electrode(A) and Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode(B)

图3 裸石墨烯碳糊电极(A)和金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极(B)的能量色散X射线(EDX)光谱表征图Fig.3 EDX sepctra of bare graphene carbon paste electrode(A) and Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode(B)

2.2 金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极的循环伏安特性

以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为分子探针，考察了不同电极的电化学性能，结果如图4所示。在裸石墨烯碳糊电极上，出现了一对峰形较好的氧化还原峰，其中氧化峰的峰电位为Epa=0.30 V，峰电流为Ipa=1.4 μA；还原峰的峰电位为Epc=0.20 V，峰电流为Ipc=1.5 μA。在金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极上，同样可以观察到一对峰形较好的氧化还原峰，其中氧化峰的峰电位为Epa=0.27 V，峰电流为Ipa=3.3 μA；还原峰的峰电位为Epc=0.19 V，峰电流为Ipc=3.2 μA。显然，金纳米粒子的修饰使分子探针的电化学响应得到了显著改善。这可能是由于金纳米粒子的修饰改变了电极的表面结构，有效增大了电极的比表面积，这与扫描电镜表征的结果相一致。

2.3 同型半胱氨酸在不同电极上的电化学响应

对同型半胱氨酸在不同电极上的电化学响应进行了考察，结果如图5所示。在裸石墨烯碳糊电极上，当底液中没有同型半胱氨酸时，观察不到电化学响应(曲线d)；当底液中含有同型半胱氨酸时，仅在0.14 V观察到一个微弱的氧化峰，峰电流为0.052 μA(曲线c)。在金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极上，当底液中未添加同型半胱氨酸时，可在0.42 V左右观察到一个峰形较宽的氧化峰，峰电流为0.18 μA，对应于金纳米粒子的氧化；向底液中加入同型半胱氨酸后，则在0.46 V出现了一个峰形尖锐的氧化峰，峰电流为：0.79 μA。显然，金纳米粒子的修饰使同型半胱氨酸的氧化峰电流从0.052 μA增大至0.79 μA，增大了14.2倍，说明金纳米粒子对同型半胱氨酸具有良好的富集效应和电催化作用。

图4 裸石墨烯碳糊电极(实线)以及金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极(虚线)在5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 和1 mol/L KCl溶液中的循环伏安图(扫描速率：100 mV/s)Fig.4 Cyclic voltammograms of bare graphene carbon paste electrode(solid line) and Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode(dash line) in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] and 1 mol/L KCl solution(scan rate:100 mV/s)

2.4 扫描速率对同型半胱氨酸电化学响应的影响

为探究同型半胱氨酸在金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极上的电化学反应机理，采用线性扫描伏安法，考察了扫描速率对同型半胱氨酸伏安响应的影响，结果如图6A所示。在50～300 mV/s的扫描速率范围内，氧化峰电流随扫描速率的增大而线性增加，Ip(μA)=9.7×10-4v+0.065(R=0.94)(图6B)，表明同型半胱氨酸在金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极上的电化学氧化反应是一个受吸附控制的过程。同时，同型半胱氨酸在传感器上的电化学氧化又是一个完全不可逆的过程，根据Laviron理论[22]，对于受吸附控制的完全不可逆的电化学反应过程，峰电位与扫描速度的自然对数成线性关系，关系式如下：

(1)

式中：E0′是形式电位，α是电子转移系数，k0是标准速率常数，n是电子转移数，F是法拉第常数。

对于完全不可逆的受吸附控制的过程，α一般取0.5。本体系中，峰电位与扫描速度的自然对数之间的关系为：Ep(V)=0.1+0.065lnv(mV/s),R=0.98(图6C)。根据公式(1)，我们可以计算出n=0.8≈1，即：同型半胱氨酸在传感器上的电化学氧化过程是一个一电子参与过程。

2.5 底液pH值对同型半胱氨酸电化学响应的影响

对底液pH值的影响进行了考察，结果如图7A所示。当底液pH值从5.0逐渐升高至9.0时，同型半胱氨酸的氧化峰电流先是逐渐增大，在pH=7.0时达到最大，之后又逐渐减小(图7B)。这可能是由于当底液pH值为7.0时，修饰电极对同型半胱氨酸具有较好的富集效应。因此，本体系选择7.0为检测底液的最佳pH值。此外，随着底液pH值的升高，同型半胱氨酸的氧化峰电位逐渐负移，且与pH值呈线性关系：Ep=0.77-0.051pH(R=0.93)。由Ep-pH关系曲线的斜率-0.059(m/n)pH(m为反应中转移的质子数，n为转移的电子数，在本体系中n≈1)，可计算出：m≈1。故同型半胱氨酸在传感界面上的反应是一个一电子一质子参与的电化学过程。结合文献报道[23,24]，推测同型半胱氨酸在传感器上的电化学反应机理如下：

2.6 传感器性能评价

2.6.1 线性范围、灵敏度、检出限和响应时间采用安培响应法对传感器的部分性能进行了评价，结果如图8所示。经数据分析可知，当同型半胱氨酸的浓度在3.0～100 μmol/L范围内时，其氧化峰电流与其浓度呈良好的线性关系：Ip(nA)=2.29+1.22c(μmol/L),R=0.99(图8内插图)；方法灵敏度为1.22 nA/(μmol/L);检出限为0.8 μmol/L；响应时间为3 s。

图8 不同浓度HcySH在金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极上的安培响应图(内插图为HcySH的氧化峰电流与其浓度之间的线性关系图)Fig.8 Amperometric response of different concentrations of HcySH at Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode in 0.25 mol/L PBS(pH=7.0) with the operation potential of 0.4 V(Inset:The linear relationship between the oxidation peak current of HcySH and its concentration)

2.6.2 抗干扰能力、稳定性及重现性借助安培响应法，对传感器的抗干扰能力进行了评价，结果显示10倍的Cl-,5倍的Na+、K+、Ca2+，1.3倍的Mg2+，0.1倍的抗坏血酸、尿酸对100 μmol/L同型半胱氨酸的测定不产生干扰(信号变化小于±5%)。说明该传感器对无机离子的抗干扰能力较好，但对生物小分子的抗干扰能力有待进一步提高。

此外，借助于线性扫描伏安法，对传感器的稳定性和重现性进行了考察。将传感器放置7 d后再进行平行测定，检测信号依旧可以保持为初始信号的92%，说明传感器具有较好的稳定性。用同一支金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极对100 μmol/L HcySH平行测定8次，其相对标准偏差为5.6%；用8支不同的金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极对100 μmol/L HcySH进行平行检测，其相对标准偏差为3.8%，说明传感器具有较好的重现性。

2.6.3 准确性借助于安培响应技术，采用标准加入法，对传感器检测同型半胱氨酸的准确性进行了评价，结果如表1所示。结果显示，6次测定的回收率为91.0%～103.2%，平均回收率为97.2%，表明该传感器具有一定的准确性。但传感器对生物小分子的抗干扰能力有限，因此目前还不太适用于生物样品中同型半胱氨酸的测定。在今后的研究中，课题组会将提高传感器的选择性作为研究重点，以实现传感器在生物样品中的应用。

表1 回收率实验结果Table 1 Results of the recovery experiment

3 结论

本工作将石墨烯直接用于碳糊电极的制备，省去了石墨烯的功能化及溶剂分散等步骤，在很大程度上简化了操作流程；利用简单可控的电沉积法将金纳米粒子修饰到石墨烯碳糊电极表面，从而构建了同型半胱氨酸电化学传感界面。电化学技术表征表明，金纳米粒子-石墨烯复合膜对同型半胱氨酸的电化学反应具有明显的催化作用；对纳米复合膜进行了扫描电镜和能量色散X射线光谱表征，对同型半胱氨酸在传感界面上的反应机理进行了探讨，并对传感器的各项性能进行了评价。传感器基本性能良好，但对生物小分子的抗干扰能力有待进一步提高，这在一定程度上限制了其在生物医学领域的应用，也是本工作后续研究的要点。