2015—2017年新疆动物源鼠伤寒沙门菌耐药性分析

轩慧勇 宋强强 刘雪连 宋超慧 徐琦琦 秦 蕾 夏利宁*

(1.新疆农业大学 动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.北京大北农科技集团股份有限公司，北京 100192)

鼠伤寒沙门菌是重要的人兽共患肠道致病菌，同时也是临床常见的非伤寒沙门菌致病血清型[1]，对动物和人的感染率和致病力都很高。在抗菌药物的选择压力下，多重耐药(Multi-drug resistance，MDR)鼠伤寒沙门菌的检出率迅速增加并呈全球化扩散，在欧美和亚非等世界各地广泛传播[2-3]。Kijima等[4]、Porter等[5]和Wang等[6]均报道鼠伤寒沙门菌的耐药率有逐年上升趋势，耐药问题已成为公共安全卫生领域的核心问题之一。耐药基因的携带是耐药菌株产生耐药的主要原因之一，耐药基因可位于细菌的染色体上或质粒上，在人和动物的肠道内通过水平方式和垂直方式进行耐药基因/质粒等的传递，造就超级细菌[7]，还可以通过医院、养殖场的废水及动物和人的排泄物排放至环境造成污染，由此带来的耐药问题和食品安全问题也越来越严重。而有关新疆动物源鼠伤寒沙门菌的耐药情况鲜见报道，鼠伤寒沙门菌在新疆多种动物中的分布及基因携带情况尚不明确。

本研究以新疆地区2015—2017年3年内分离的宠物源(犬和猫)、鸡源、牛源、羊源和猪源鼠伤寒沙门菌为研究对象，分离不同动物源的鼠伤寒沙门菌，旨在了解不同动物源鼠伤寒沙门菌的流行情况、耐药性以及耐药基因携带情况，对耐药株的防控具有重要意义，同时为深入了解鼠伤寒沙门菌的多重耐药机制提供材料和基础数据。

1 材料与方法

1.1 质控菌株和试验用沙门菌

大肠埃希标准质控菌(ATCC25922)购自天和微生物试剂有限公司(杭州)；试验用沙门菌来源于新疆农业大学动物医学学院药理实验室2015—2017年期间分离鉴定并保存的不同动物源沙门菌。菌株背景：2015年乌鲁木齐宠物源(犬和猫)沙门菌39株；2016年伊犁地区猪源沙门菌38株、牛源沙门菌99株和鸡源沙门菌62株；2016年焉耆地区猪源沙门菌27株、牛源沙门菌62株、鸡源沙门菌85株和羊源沙门菌17株；2017年石河子地区采集猪源沙门菌81株。共有不同动物源沙门菌510份，从中鉴定获得的鼠伤寒沙门菌用于试验。

1.2 培养基及试剂

氯化镁孔雀绿增菌液(Rappaport-Vassiliadis Medium，MM)、MH(Mueller-Hinton)培养基、SS琼脂和沙门显色培养基均购自奥博星生物技术有限公司(北京)；甘油和50×TE缓冲液购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2 000 DNA Maker购自天根生化科技(北京)有限公司；BstF5I酶购自NEB公司；2×Taq PCR Master Mix、琼脂糖和核酸染料均购自天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 沙门菌的复苏及模板的制备

对本实验室通过沙门显色培养基分离鉴定后得到的菌株进一步通过PCR扩增检测携带invA基因[8]的沙门菌进行复苏，并进行模板的制备。方法为：挑取沙门菌单菌落于1 mL MH肉汤中，37 ℃ 200 rpm过夜培养，吸取200 μL菌液1 3000 g离心 1 min 弃上清；加500 μL 1×TE缓冲液重悬，13 000 g 离心1 min弃上清；加200 μL 1×TE缓冲液重悬，沸水煮2 min，冰浴2 min；13 000 g离心5 min，取50～60 μL上清即DNA模板，-20 ℃保存备用。

1.4 沙门菌的血清型鉴定

根据沙门菌血清型特异性基因进行鼠伤寒沙门菌血清学鉴定，检出spy基因的沙门菌即为鼠伤寒沙门菌[9]，引物均根据文献由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列见表1。PCR扩增产物经测序比对，相似性>96%判定为该菌株的鉴定结果。

表1 本研究所用的引物信息

1.5 药敏试验

采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)发布的M100-S26抗微生物抗菌药物敏感性试验的执行标准[10]，运用琼脂稀释法进行12种抗菌药物最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations，MICs)的测定，依照CLSI2017版执行标准判定结果。测试药物包括临床常用抗菌药物以及部分备选抗菌药物：环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)、庆大霉素(GEN)、氨苄西林(AMP)、头孢噻呋(CEF)、头孢曲松(CRO)、亚胺培南(IPM)、四环素(TET)、氟苯尼考(FFC)、多粘菌素(CL)、磺胺异恶唑(SMZ)和磷霉素(FOS)。

1.6 耐药基因检测

对分离鉴定的鼠伤寒沙门菌进行β-内酰胺酶基因(blaTEM、blaCMY-2和blaSHV)、氟喹诺酮耐药(Plasmid mediated fluoroquinolone resistant，PMQR)基因(qnrD、qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib)、四环素类耐药基因(tetA和tetB)、氨基糖苷类耐药基因(rmtB、aadA2和ant(3″)-Ia)、酰胺醇类耐药基因(floR)、磺胺类耐药基因(sul1)和多肽类耐药基因(mcr-1)的检测[11-14]。用BstF5I酶进行酶切已检出aac(6′)-Ib基因的PCR产物，如果存在-cr突变，aac(6′)-Ib基因因失去BstF5I酶的限制性位点不能被切开。

2 结果与分析

2.1 不同动物源鼠伤寒沙门菌的分离鉴定

510份不同动物源沙门菌，经PCR扩增检测spy基因后得到162株鼠伤寒沙门菌，分离率为31.8%。图1为部分spy基因PCR检测结果。不同动物源鼠伤寒沙门菌的分离率如下：2015年乌鲁木齐鼠伤寒沙门菌的分离率为100.0%(39/39)；2016年伊犁地区猪源、牛源和鸡源鼠伤寒沙门菌的分离率依次为0%(0/38)、1.0%(1/99)和1.6%(1/62)；2016年焉耆地区猪源、牛源、鸡源和羊源鼠伤寒沙门菌的分离率依次为40.7%(11/27)、48.4%(30/62)、10.6%(9/85)和47.1%(8/17)；2017年石河子猪源鼠伤寒沙门菌的分离率为77.8%(63/81)(表2)。

1～9：试验菌株；M：DNA Marker；+：阳性对照；-：阴性对照

对分离结果采用卡方检验进行统计学分析，结果显示，宠物源分离率显著高于其他动物源(P<0.05)，羊源和猪源分离率无统计学差异(P>0.05)，鸡源分离率最低(表2)。

表2 动物源鼠伤寒沙门菌的分离情况

2.2 动物源鼠伤寒沙门菌耐药及多重耐药情况

不同动物源鼠伤寒沙门菌对被检测的抗菌药物呈现高耐药和高敏感结果(表3)，耐药率从高到低依次为宠物源，羊源，猪源，牛源和鸡源。不同动物源鼠伤寒沙门菌对磺胺异恶唑的耐药率均为100.0%，对环丙沙星、氨苄西林、四环素和氟苯尼考的耐药率超过80.0%；其中，以宠物源鼠伤寒沙门菌耐药谱最宽，对被检测的12种抗菌药物中的9种抗菌药物耐药，羊源鼠伤寒沙门菌对其中7种抗菌药物耐药，其余动物源鼠伤寒沙门菌都对其中5种抗菌药物耐药；仅宠物源鼠伤寒沙门菌对头孢曲松和亚胺培南各检出1株耐药菌株，对多粘菌素检出2株耐药菌株，其余动物源鼠伤寒沙门菌均对头孢曲松、亚胺培南和多粘菌素高度敏感，无耐药菌株检出；除猪源鼠伤寒沙门菌对庆大霉素检出3株耐药菌株外，其余动物源鼠伤寒沙门菌对庆大霉素无耐药菌株检出。

表3 动物源鼠伤寒沙门菌对12种抗菌药物的耐药率

162株动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药在0～9耐有分布，3耐及3耐以上菌株占98.1%(159/162)。不同动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药均以5耐为主(宠物源5耐占94.8%、牛源5耐占93.6%、羊源5耐占87.4%、鸡源5耐占80.0%、猪源5耐占71.5%)(表4)。

表4 动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药率

162株动物源鼠伤寒沙门菌共有12种耐药谱型，不同动物源鼠伤寒沙门菌耐药谱型均以5耐谱型CIP-AMP-TET-FFC-SMZ为主，且宠物源(94.8%)、牛源(93.6%)和羊源(87.5%)的5耐谱型菌株数达85.0%以上；以猪源鼠伤寒沙门菌耐药谱型最多，共有7种谱型，宠物源鼠伤寒沙门菌和牛源鼠伤寒沙门菌各有3种耐药谱型，而羊源和鸡源鼠伤寒沙门菌各有2种耐药谱型(表5)。

表5 动物源鼠伤寒沙门菌耐药谱型

2.3 动物源鼠伤寒沙门菌耐药基因检测

不同动物源鼠伤寒沙门菌均检出β-内酰胺酶基因、四环素基因、氨基糖苷类基因、酰胺醇类基因和磺胺类基因。除猪源菌以携带β-内酰胺酶基因blaCMY-2(93.2%)为主外，其余动物源菌以携带blaTEM基因为主，blaTEM基因检出率在60.0%以上；不同动物源鼠伤寒沙门菌四环素耐药基因均以携带tetB基因为主，检出率高达80.0%以上，仅在猪源鼠伤寒沙门菌中检出tetA(5.4%)基因；不同动物源鼠伤寒沙门菌PMQR因子均以携带oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib-cr基因为主，检出率达50.0%以上，且aac(6)-Ib基因均存在-cr突变，仅在宠物源菌中检出qnrS(97.4%)基因。此外，不同动物源鼠伤寒沙门菌氨基糖苷类耐药基因以携带aadA2和ant(3″)-Ia为主，检出率达60.0%以上，对酰胺醇类耐药基因floR和磺胺类耐药基因sul1的检出率也在50.0%以上，不同动物源鼠伤寒沙门菌均未检出多肽类耐药基因mcr-1(表6)。

4 讨 论

沙门菌是人畜共患病和食物中毒的主要食源性病原菌之一，除在自然界中分布极广外，鸡、鸭、猪、牛、羊等家禽和家畜动物肠道也广泛分布，给养殖业和食品安全造成潜在危害[15]。鼠伤寒沙门菌是食源性沙门菌的优势血清型，如广西、河北、河南和广东等都有报道[16]。本研究分离结果显示，不同动物源鼠伤寒沙门菌的整体分离率为31.8%，其中，以宠物源鼠伤寒沙门菌的分离率最高，达100.0%，羊源和猪源鼠伤寒沙门菌的分离率也达到47.0%以上。本研究从不同动物源中均分离出鼠伤寒沙门菌，说明鼠伤寒沙门菌在自然界中宿主广泛，若从蛋肉产品中检出耐药鼠伤寒沙门菌，则会存在食品安全隐患。此外，耐药鼠伤寒沙门菌可在人和动物之间通过食物链甚至是与宠物亲密接触时进行传递，为保障公共卫生安全，应加强耐药鼠伤寒沙门菌的监测。

本研究对新疆地区不同动物源分离的鼠伤寒沙门菌药敏试验结果显示，新疆地区鼠伤寒沙门菌耐药现象十分严重，以宠物源鼠伤寒沙门菌耐药谱最宽，对被检测的9种抗菌药物耐药，但对头孢噻呋、头孢曲松和亚胺培南均检出1株耐药株，可能是宠物主人擅自对宠物使用人用药物或不按疗程给宠物用药造成的。不同动物源鼠伤寒沙门菌对被检测的抗菌药物磺胺异恶唑的耐药率高达100.0%，与张增峰[17]报道的上海市零售肉中和环境中鼠伤寒沙门菌的耐药结果一致，但耐药率高于夏宇飞等[18]报道的湖南地区猪源及鸡源对磺胺异恶唑的耐药率(60.0%～70.0%)，药敏结果显示出不同地区以及不同动物源由于使用抗菌药物的种类和剂量的差异，其耐药结果也相差较大[17-18]。此外，不同动物源鼠伤寒沙门菌对环丙沙星、氨苄西林、四环素和氟苯尼考的耐药率高达80.0%以上，耐药率与罗学辉等[19]报道的河水、食品及食源性疾病患者中鼠伤寒沙门菌耐药结果一致，分析原因可能是以上几种药物性价比高，容易获得，长期不合理的使用甚至滥用，导致高水平耐药菌株的出现。鼠伤寒沙门菌对庆大霉素、头孢噻呋、头孢曲松和多粘菌素的耐药率处于较低的水平，耐药率在2.6%～5.1%，可作为治疗细菌性疾病的备选药物，但由于鼠伤寒沙门菌要较其他血清型的沙门菌更易产生耐药性[15]，因此在治疗时要注意药物的使用频率和剂量，降低耐药菌的产生率。

多重耐药结果显示，不同动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药率达98.0%以上，与段瑶等[20]报道的畜禽鼠伤寒沙门菌多重耐药率(90.44%)基本一致，本研究中以5耐菌株占比最高，达77.8%，8耐及以上耐药菌株占比达10.4%，多重耐药结果显示出新疆不同动物源鼠伤寒沙门菌对临床使用的很多抗菌药物已普遍产生耐药性，不仅耐药率高，并且对抗菌药物的交叉耐药现象严重，进而增加多重耐药菌的感染率。不同动物源鼠伤寒沙门菌共有12种耐药谱型，以猪源耐药谱型最多，有7种耐药谱型，分析原因是相对于其他动物，猪养殖基本趋于规模化，养殖过程中猪只更易感染细菌性疾病。此外，养殖场为了避免猪只患病，也可能会饲喂含有抗菌药物的饲料，故而猪只使用抗菌药物的频率和种类较其他动物多，因此猪源鼠伤寒沙门菌具有较宽的耐药谱型。本研究中不同动物源多重耐药优势表型为CIP-AMP-TET-FFC-SMZ，耐药谱宽，多重耐药严重。四环素、氟苯尼考和磺胺异恶唑都是长期使用在动物养殖过程中的药物，该耐药谱型的形成与这些抗菌药物的使用密切相关。此外，鼠伤寒沙门菌在用药的环境中，部分菌株通过染色体的局部抑制基因突变，抑制孔蛋白表达，进而使抗菌药物无法进入菌体内，也是沙门菌在长期进化过程中产生耐药性的原因[21]。

细菌携带耐药基因是其耐药性产生和传播的主要原因之一。本研究对七大类16种耐药基因检测结果显示，不同动物源鼠伤寒沙门菌除对多肽类耐药基因未检出外，对其他六类被检测的抗菌药物的耐药基因均有检出，除猪源鼠伤寒沙门菌对blaTEM和tetA基因的检出率为6.8%和5.4%以外，不同动物源鼠伤寒沙门菌对其余检出的耐药基因的检出率高达50.0%以上，本研究耐药结果显示出新疆不同动物源鼠伤寒沙门菌耐药基因携带率很高。值得注意的是，鼠伤寒沙门菌对β-内酰胺类药物耐药主要是由于产生β-内酰胺酶，并以blaTEM型、blaCTX-M型、blaOXA型和blaSHV型较为常见[21]，本研究结果显示，宠物源、羊源和鸡源鼠伤寒沙门菌均以携带blaTEM型为主，该耐药基因的检出率在62.5%以上，但猪源鼠伤寒沙门菌却以携带blaCMY-2型为主，虽然都是介导对β-内酰胺类药物的耐药，但不同动物源主要携带的耐药基因却不同。此外，blaTEM基因可以在不同菌株间进行水平传播和垂直传播，而携带blaTEM基因的阳性菌株通常都带有多重耐药，给多重耐药菌的防控造成巨大压力[22]。此外，本试验发现耐药表型与耐药基因型不完全正相关，如羊源鼠伤寒沙门菌对酰胺醇类和磺胺类的耐药率高达100.0%，但相关耐药基因floR和sul1的检出率为50.0%～62.5%。耐药基因的位置、表达情况及不同耐药基因之间的相互作用会影响细菌对抗菌药物的耐药性，具体机制有待进一步研究。新疆地广人稀，故监测范围有限，且样本数量和样本收集年限有限，不能十分全面反映出新疆近年来不同动物源鼠伤寒沙门菌的耐药情况。应在全疆范围内加大对鼠伤寒沙门菌菌株的监测，进而提供更全面的结果。

综上，新疆不同动物源耐药鼠伤寒沙门菌分布广泛，对环丙沙星、氨苄西林、四环素、氟苯尼考和磺胺异恶唑等常用抗菌药物高度耐药，可根据药敏结果选用头孢噻呋和庆大霉素等敏感性较高的抗菌药物来提高疗效。不同动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药严重，具有相同耐药谱型，且耐药基因携带率高，存在克隆传播的风险。为更全面掌握新疆动物源性鼠伤寒沙门菌的耐药情况，应对鼠伤寒耐药沙门菌进行长期监测，实现实验室和流行病相结合的监测模式，进而更好的保护动物和人类健康。