我国天然纤维植物纤维素合酶基因研究进展

黄欣智，姜雅轩，孙向前，付泽元，徐启江

(东北林业大学，哈尔滨 150036)

21世纪以来，随着以煤炭和石油为主的不可再生能源的不断消耗，人类逐渐将目光投向可再生能源。纤维素作为可再生能源的一种，年产高达几亿吨甚至更多，越来越受到学术界的关注。纤维素由吡喃式D-葡萄糖为单体组成，由β-1，4-糖苷键连接，约有2 500个葡萄糖残基。在植物体内，纤维素的存在形式是微纤维。一般来说，微纤丝是从36个β-1，4-葡萄糖苷链结晶的，它们贯穿每个细胞。微纤丝通过半纤丝连接，形成网络结构，可以帮助植物支撑和承受机械压力[1]。纤维素也是植物细胞壁的最主要成分，从内向外植物的细胞壁可以分为三部分，即次生壁(secondary cell wall，SCW)、初生壁(primary cell wall，PCW)和胞间层(intercellular layer)。次生壁是细胞成熟停止生长之后合成的，细胞壁是木质化的，坚硬的，刚性的，机械性强的，对植物细胞具有很强的保护作用；初生壁是细胞生长期合成的细胞壁，其特点是质地柔软，具有可塑性。半纤维素、果胶和木质素是除纤维素外的植物细胞壁的组成成分。

植物的纤维是一种絮状物，由植物的纤维素和其他营养物质组成，主要在植物体内起支撑、连接、包裹和充填的作用。天然植物纤维是指直接从植物中获得的纺织纤维，植物来源可能是天然存在或人工培育。天然植物纤维是纺织工业的重要材料来源，目前，几乎所有的天然纤维都来自棉花和各种麻类作物。在我国，棉麻作物的种植历史悠久，研究其纤维的合成对于提高棉麻纤维质量、培育新品种具有重要的意义。综述了近年来对纤维素合酶的研究特别是对天然植物纤维的CesA研究取得的进展。

1 高等植物的纤维素合酶

高等植物纤维素合酶是由一种玫瑰状或莲花状的纤维素合酶复合体(Cellulosesynthasecomplex，CSC)合成的，这种酶定位在细胞膜之上，含有六个大亚基，每个亚基含有至少3种纤维素合成酶(Cellulosesynthase，CesA)蛋白，形成一个36单体复合体[2]，有人用复合的复合物(complex complex)来形容它。CSC中含有大量蛋白质，包括CesA蛋白，CSL(类纤维素合酶)蛋白，UDPG(UDP-葡萄糖)形成相关的蛋白，纤维素内切酶(KORRIGAN)，细胞骨架蛋白(微管蛋白和肌动蛋白)等[3]，其中CesA蛋白作为重要组成部分，是复合物的催化亚基[4]。纤维素合成酶最初是从人类的细菌中鉴定出来的[5-6]。1995年，Saxena和Brown在醋酸杆菌(Acetobacterxylinum)中鉴定出了细菌的纤维素合酶[7]，他将细菌纤维素合成酶作为鉴定植物的纤维素合成酶的工具。后来，人们从许多植物中鉴定出CesA，包括拟南芥[8]、棉花[9]、玉米[10-11]等。研究表明：即使在同一植株的不同位置，不同的CesA基因也有不同的表达，因为3个CesA蛋白可以组装成1个亚基，3个CesA蛋白之间可以不同，也可以相同。以拟南芥为例，人们在拟南芥中共鉴定出10种CesA基因，发现AtCesA1、AtCesA2、AtCesA4、AtCesA5、AtCesA6、AtCesA9和细胞初生壁表达有关，AtCesA4、AtCesA8、AtCesA9与拟南芥细胞壁次生壁的合成密切关联，而AtCesA10表达具有强烈的组织特异性，只在角果后期和种子形成初期强烈表达[12]。

通过对小麦的研究，人们发现了类似的结论：小麦的CesA1、CesA2、CesA4、CesA5、CesA6、CesA9和细胞初生壁表达有关，而CesA4、CesA8、CesA9参与次生壁表达[13]。CesA基因的突变会导致植物纤维素合成受阻。研究表明，水稻bc6突变体(OSCesA9基因半显性突变体，在该基因的高度保守区发生错义突变)植株中，茎秆的纤维素含量减少了38%[14]。CesA基因的长度大多介于3.5～5.5 Kb，一般有9～13个内含子，内含子的多少和基因的结构差异有关。CesA基因编约1 000个氨基酸的肽链，一般介于988～1 088。它们之间的一致性为 53%～98%[15]。1995年，Delmer为纤维素合成酶基因的命名制订了规则：纤维素合成酶(cellulosesynthase)由Ces表示，种属名置于其在前面，基因后面的“A(B)”表明它编码细菌催化亚基的同源体，此后这种规则在命名此类基因是得到了沿用[16]。例如：AtCesA表示拟南芥纤维素合成酶(idopsisthalianacellulosesynthase)。目前的植物纤维素生物合成模型分为三部分：其一，在蔗糖合酶作用下，UDP-葡萄糖提供底物；其二，由不同的CesA组成的CesA蛋白组装形成玫瑰状的CSC复合物，该复合体聚合葡萄糖单体形成链，同时UDP释放后被回收，并返回至蔗糖合酶继续作为纤维素合成的底物；其三，纤维素酶KORRIGAN (Kor)对有缺陷的葡聚糖链进行切割，催化其转换为纤维素微纤丝[17]。

2 纤维素微纤丝合成其他有关蛋白

除了CesA蛋白之外，还存在一类类纤维素合成酶蛋白(cellulosesynthase-like,Csl)，也是糖基转移酶家族的一员，在 β-1，4- 甘露糖苷和 β-1，4- 葡萄糖苷键以及葡甘聚糖骨架合成过程中起着重要作用。Csl家族包括CslA/B/C/D/E/F/G/H/J 亚家族[18-19]。研究表明：花粉管发育需要CSLD1和CSDL4，CSLD2，这是正常根毛形成所需的。当CsLD出现突变，会对花粉管壁纤维素的沉积产生严重的影响[20-21]。

3 我国麻类作物CesA的研究进展

2006年，田志坚[22]利用拟南芥纤维素合成酶AtCesA7保守区设计引物，后续用RACE法克隆该基因，首次从苎麻中分离得到一个3276 bp的片段，利用BLAST在线分析软件对片段进行分析，发现该片段和已知的拟南芥、玉米、马铃薯等植物CesA有很高的同源性，但是缺少5’端的部分序列，说明他成功克隆到了缺少5’部分序列的BnCesA基因，并因为该基因和拟南芥AtCesA1同源程度较高，故命名为BnCesA1。同时，利用RT-PCR技术对苎麻的不同部位进行半定量检验，发现该基因在茎叶芽根4个部位都有表达，含量大小依次减小。在次生生长的茎和初生生长的芽中的表达表明，该基因在PSW,RSW中都表达，从而证实该基因表达不具有特异性。田志坚，易容[22-24]等人构建了BnCesA1反义表达载体，并将其用于烟草转化。发现转移到BnCesA1的烟草和正常烟草相比，有明显间隙出现在叶柄横截面基本组织细胞间，细胞之间连接变得松散，细胞膨大。因此推测出是导入BnCesA1反义表达载体的烟草细胞壁合成受到抑制，导致纤维素含量出现下滑。之后，蒋杰[25]、刘昱翔[26]等人陆续克隆了BnCesA1、BnCesA2、BnCesA3、BnCesA4、BnCesA5、BnCesA6、BnCesA7(部分)。分析这些基因长度为3 120～3 270 bp，具有CesA蛋白的特征结构域，在进化上类似于玉米、棉花、拟南芥CesA结构。采用荧光实时定量PCR(qrt-PCR)技术对4个不同苎麻品种的4个BnCesA2、BnCesA3、BnCesA4、BnCesA5基因进行木质部和韧皮部表达分析，结果表明：这4个基因在木质部和韧皮部的表达不存在特异性和规律性。在整个BnCesA2、BnCesA4中，4个品种的表达含量明显高于BnCesA3、BnCesA5，这在一定程度上表明前者在苎麻纤维素合成过程中可能具有更重要的作用。

亚麻是自花授粉植物，基因组和植株都较小。目前，亚麻是研究纤维素合酶的较理想模型。高原[27-28]成功克隆到了6个LusiCesA片段(LusiCesA1、LusiCesA2、LusiCesA3、LusiCesA4、LusiCesA5、LusiCesA6)和5个LusiCSLD基因片段(LusiCSLD1、LusiCSLD2、LusiCSLD3、LusiCSLD4、LusiCSLD5)。通过BLAST分析发现，这些基因和杨树、拟南芥、玉米等植物的相似性在80%以上。吴建忠[29]在已报道部分序列文献[30]的基础上，设计特异性的引物，高保真PCR，最后测序后得到了亚麻LusiCesA1基因的全长序列，该基因序列长3 225 bp，利用交错延伸PCR技术验证了这一结果，确定片段为LusiCesA1全长。于莹等[31]克隆了亚麻纤维素合成酶LusiCesA8，在对其进行序列分析后，开放读码框全长2 967 bp，共编码988个氨基酸。通过BLAST比较，该基因与麻风树、胡杨等植物的CesA8同源性较高，并通过qRT-PCR技术对两种不同的亚麻CesA8进行表达分析。结果表明，两种物种之间的基因表达模式具有很高的一致性。基因的表达在幼苗期(BBCH19)到快速生长期(BBCH32)由较低状态升至顶峰，过渡到现蕾期时该基因的表达量又出现下降，至花期(BBCH65)恢复，并又一次到达了峰值。出现蒴果之后表达含量开始下降，但随蒴果数量增加，该基因表达量逐渐增加。吴建忠[32]利用基因敲除获得亚麻LusiCesA1 缺失突变体，成功构建了SSH抑制消减文库，通过抑制差减杂交，构建了亚麻纤维素合酶CesA1基因的cDNA文库，之后进行逆向斑点杂交验证阳性克隆，发现了有122个基因表达存在差异，其中27个未知，95个则是已知基因的同源克隆。推测发觉这些基因中可能对该基因上调表达的基因功能克隆以三类为主：影响代谢途径、改变蛋白质命运、调节蛋白质合成，共计约占30%。袁红梅等人[33]利用Phytozome数据库的亚麻基因组共鉴定了 45 个亚麻CesA/Csls家族基因成员，它们分属于两类，7 组，在 scaffolds 上分布，基因结构和蛋白基序在组间具有多样性，在组内具有保守性。在不同发育阶段，各种不同的基因存在着一定的时空特异性，同时发现CesA/Csls中的一些基因可以对于激素 BR、Brz 及NaCl 胁迫产生一定响应。江海霞[34]等人研究了亚麻快速生长期茎纤维CesA的表达情况，发现快速生长期亚麻茎韧皮纤维细胞壁没有次生加厚过程。在亚麻细胞壁伸长过程中，有LusiCESA1、LusiCESA3、LusiCESA9和LusiCESA10基因的参与。

4 棉花纤维素合酶CesA研究进展

1996年，pear从陆地棉中鉴定出了两个CesA基因，这是人类首次从高等植物中鉴定出的纤维素合酶基因[35]。王如意克隆了GhCesA6和GhCesA7，发现GhCesA6在棉纤维整个发育时期表达量都很高，说明该基因在棉纤维初生壁的合成中起重要作用，GhCesA7在次生壁中大量表达，同时发现GhCesAs的表达含量会在对提取的棉细胞膜蛋白加入纤维素酶后出现提升，加速纤维素的体外合成[36]。范建克隆了GhCesA5、GhCesA8、GhCesA10，并进行了生物信息学分析和抗体制备。他在对CesA复合体鉴定过程中发现，除了有已经报道过的CesA家族、SuSy家族及细胞骨架蛋白(actin等)，还有纤维素内切酶，但目前并没有证据证明该酶是CesA复合体的一部分，这可能为解析纤维素合酶的功能提出了一个新的方向[37]。通过Western bloting发现，在整个棉纤维的发育时期，GhCesA5和GhCesA10都有很高的表达量，是典型的初生壁纤维素合酶基因；GhCesA8在初生细胞壁形成时期不表达，但是进入次生细胞壁合成时期，表达含量突然急剧增加，说明它是次生细胞壁合成基因[38]。李先良在次生生长旺盛的棉纤维细胞中鉴定出了两种CesA：初生细胞壁合成的和次生细胞壁合成的CesA，这种结果和拟南芥研究中发现的一致，推测出CesA可能形成两种不同类型复合体，初生壁合成复合体和次生壁合成复合体。CesA及复合体在初生壁和次生壁中的不同可能是导致棉花初生次生纤维聚合度不同的原因[39-40]。

5 展望

细胞壁是植物细胞的重要结构，在植物结构组成中起着重要作用。细胞中也存在着一种次生增厚的现象，如厚壁细胞、纤维细胞、管状导管等。细胞壁的主要成分是纤维素，次生加厚的主要物质是木质素，为次生加厚的细胞提供了保护和抵抗损伤及病原体的能力。植物纤维素合成机制一直是研究人员关注的问题。纤维素的合成调节涉及多个方面，包括CesA蛋白的表达、调控、修饰和分泌，胞质中CSC复合体的装配，纤维素的合成与沉积[33]。在棉花和麻类植物中，人类能利用的最重要的是其天然纤维。对这些植物的纤维素的研究可以帮助人类提高其纤维质量，从而进一步培育出纤维性能更好、纤维产量更高的优良品种。20多年来，纤维素合成酶的研究取得了很大进展，然而对于天然纤维植物的纤维素合成酶的研究才刚刚开始，许多基因尚未得到深入研究，特别是类纤维素合成酶CSL蛋白，目前其功能和分子生物学机制还不是很清楚，有待进一步研究。

对于麻类作物的纤维素合酶研究，不仅可以通过对纤维素合酶基因进行研究，还可以从分子生物学的手段入手，通过CRISPER、RNAi、miRNA、转录组等分子生物学手段进行研究。例如：在亚麻茎的激光显微解剖采集样本，发现了在韧皮部纤维侵入性伸长过程中表达差异的miRNA及其靶基因，如miR396s。该基因家族和它们的靶点(如生长调节因子)与更晚发育的纤维和不同细胞类型的纤维相比，miR396家族的几个成员在侵入性纤维伸长过程中出现了下调，这表明miR396家族的表达具有组织特异性和阶段特异性，说明miR396、AGO7和miR390等复杂网络可能在侵入性延伸过程中发挥重要的调控作用，这种现象可能和植物的激素调节有关，如miR160，就和生长素调节有关[41]。还有研究表明，在亚麻中发现了大量的保守植物miRNA，其可能在亚麻的生长发育中发挥重要作用，这就给亚麻纤维的生长研究提供了新的思路[42]。

研究表明，磷酸化或s-酰化等翻译后修饰调控纤维素的合成，且一些蛋白因子参与了纤维素合成的调控，如金属硫蛋白[43]，在其他植物中已经证明了金属硫蛋白在其中的作用。富含纤维素的植物细胞类型金属硫蛋白(metallothionein)通过向GhCESA蛋白的锌结合域提供锌离子，参与了CESA复合物的形成调控[44]，这同样为这些种子纤维植物的纤维素合酶研究提供了另一个思路：这些蛋白因子是如何和怎样和其纤维素合酶作用，从而达到调控表达效果。

以亚麻为实验对象，研究其14个CesA基因的在不同部位和不同生长时期的差异表达情况取得了一定的进展，待找出差异表达基因之后，就可以运用基因敲除等手段，解析不同CesA基因在亚麻中的表达情况和作用，为培育出含有更优质纤维的亚麻提供理论基础。