亚甲基丁二酸在雄性C57BL/6J 小鼠体内半数致死量和半衰期的测定

郭阳阳 ，雷和花 ，王玉兰

1. 中国科学院大学，北京100049；2. 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院波谱与原子分子物理国家重点实验室武汉磁共振中心，武汉430071；3. 新加坡表型中心，李光前医学院，生命科学院，南洋理工大学，新加坡639646

亚甲基丁二酸（itaconic acid，ITA）又名衣康酸、甲叉琥珀酸，是一种不饱和二元有机酸，因其具有活泼的化学性质，是化学工业的重要原料[1]。目前，大多数的ITA 是由土壤真菌土曲霉发酵产生的[1]。在生物体内，ITA是由三羧酸循环的中间产物顺乌头酸经顺乌头酸脱羧酶（cis-aconiticacid decarboxylase，CAD）催 化 生 成[2]。在哺乳动物体内CAD 就是免疫应答基因-1 蛋白（immuneresponsive gene 1 protein，IRG1）[2]，IRG1 是哺乳动物体内一种重要的免疫蛋白，是免疫代谢中的关键成分，是产生ITA 的关键酶。已有研究[3]证明ITA 可以抑制细菌体内的乙醛酸循环中的异柠檬酸裂合酶而达到其抗菌的效果。ITA 在巨噬细胞的线粒体合成后，可以抑制琥珀酸脱氢酶的活性[4]。与此同时ITA 也可以分泌到胞浆中抑制KEAP1的活性，从而激活核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2），导致IFN γ 和IL-1β 的含量降低[4]，使机体的炎症反应减轻。急性毒理实验可以初步了解外源化学物质急性毒性强度，从而评价外源化学物质的安全性[5]。药物半衰期（half-life）是外源性药物在体内代谢的重要参考[6]。因此，本文测定了ITA 的半数致死量（half-lethal dose，LD50）来评价其安全性，同时测定了半衰期来作为ITA 在体内代谢的一个参数，为动物实验给药的剂量和时间提供重要的依据。

1 对象与方法

1.1 试剂与仪器

ITA 购于萨恩化学技术（上海）有限公司，生产批号BH290028；生理盐水购于武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，生产批号1905300801；HPLC 级别甲醇、甲酸、乙腈购于美国Thermo Fisher Scientific 公司，生产批号19045130。Agilent 6460 UPHLC-ESI-QqQ 仪器购于美国Agilent 公司。

1.2 实验动物

8 周龄SPF 级C57BL/6J 小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证编号SCKK（湘）2016-0002]，饲养于中国科学院精密测量科学与技术创新研究院小洪山园区SPF 级实验动物中心动物房[实验动物使用许可编号SYXK（鄂）2015-0051]。适应性饲养2 周，小鼠自由摄取食物和水。温度21 ～25℃，湿度45%～70%，换气次数30 ～50 次/h，光照/黑暗的自动切换时间12 h。半数致死量实验中LD0和LD100组每组6 只小鼠，共分为7 组，LD50组每组12 只小鼠，共分为6 组。本研究经中国科学院精密测量科学与技术创新研究院伦理委员会 批准。

1.3 色谱质谱实验

取50 μL 小 鼠 血 浆 样 品，100 μL 甲 醇，50 μL 超 纯水，混匀后离心取上清。上清液用0.45 μm 滤头过滤至进样瓶中。使用超高效液相色谱系统和QQQ 串联质量分析器的Agilent 6460 三重四极杆系列采集数据，超高效液相色谱系统是配备了G4220A 二元泵和G4226 自动进样器的Agilent 1290 系列。流动相A 是水+0.01%甲酸，流动相B 是乙腈。色谱柱使用Zorbax Eclipse Plus C18（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）。色谱条件：流速0.25 mL/min；温度40℃；进样量 0.5 μL。质谱采用单离子检测（single ion monitoring，SIM）负离子模式。

1.4 半衰期和半数致死量实验

经尾静脉将ITA 注射进小鼠体内。注射完成后开始计时，并于注射后0.5 h 和2 h 时采集小鼠眼底静脉丛血液，4 ℃静止4 h，取上清制成血浆样品待测。小鼠经尾静脉注射不同浓度的ITA 后连续观察14 d 小鼠的状态和存活情况并记录，将记录的数据采用SPSS 18.0 软件计算得出半数致死量和半衰期。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 ITA LD50 的测定

ITA 经尾静脉注射入C57BL/6J 雄性小鼠体内，观察14 d 后小鼠的存活情况。通过注射5、50、500 mg/kg 的剂量确定受试浓度应该在50 ～500 mg/kg（表1）。随后，通过注射100、200、300、400 mg/kg 的剂量确定合适的受试浓度应在200 ～400 mg/kg（表2）。最后，在合适浓度范围内设置了5 个浓度进行实验（表3）。

表1 ITA 对C57BL/6J 雄性小鼠的LD0 和LD100Tab 1 LD0 and LD100 of ITA in C56BL/6J male mice

表2 ITA 对C57BL/6J 雄性小鼠的LD0 和LD100Tab 2 LD0 and LD100 of ITA in C56BL/6J male mice

表3 ITA 对C57BL/6J 雄性小鼠的LD50Tab 3 LD50 of ITA in C56BL/6J male mice

根据以上数据利用SPSS 18.0 软件计算出ITA 的LD50=258.263 mg/kg，95%CI 为（258.263±2.412） mg/kg。

2.2 ITA 半衰期的测定

ITA 经尾静脉注射入小鼠体内，注射剂量根据之前LD50的结果，选择100 mg/kg，分别于注射后0.5、2 h 眼底静脉丛取约500 μL 的全血制成血浆待测。称取1.000 0 g ITA 溶于超纯水，梯度稀释，依次配置浓度为0、0.001、0.002、0.01、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的标准品溶液。标准溶液的色谱图（图1）和质谱图（图2）中，ITA 的峰形良好，无杂质被检测到，浓度（x）和峰面积（y）线性回归方程为y=53 055.467 880×x（R2=0.994 892 91）。共测定3只C57BL/6J 雄性10 周龄小鼠的ITA 半衰期（表4）。

图1 ITA 的色谱图结果Fig 1 Chromatographic results of ITA

图2 ITA 浓度为0.02 μg/mL 的质谱图结果Fig 2 Mass spectrum of ITA at 0.02 μg/mL

表4 ITA 在C57BL/6J 雄性小鼠体内的半衰期Tab 4 Half-life of ITA in C57BL/6J male mice

半衰期的计算公式为：

其中，t0、t1为采样的2 个时间点，c0、c1为对应的浓度。

以上结果得出ITA 在C57BL/6J 小鼠体内的半衰期 t1/2=0.485 5 h =29.13 min，由此可见ITA 在 C57BL/6J 小鼠体内循环的半衰期很短。

3 讨论

ITA 通过尾静脉注射入小鼠体内之后，低剂量组别的小鼠没有任何明显的症状表现，达到致死剂量的小鼠出现呼吸加深、连续抽搐等症状，并在30 min 内死亡。根据本实验的结果，ITA 在小鼠体内属于代谢速率较高的一种药物。如果要通过体外注射的方法来增加ITA 的浓度来研究其作用，需要频繁给药，从而使得多次操作刺激，增加实验成本，实验结果可信度降低。本实验所用的ITA 的色谱质谱检测方法，线性良好，无杂质被检出，结果可信。ITA 作为一种具有抗炎效果的物质[3]，其抗炎的具体机制还没有被完全阐明，本实验的结果为今后ITA 的研究奠定了基础。

本实验条件下得出来的ITA 的LD50为258.263 mg/kg， 我国现行的急性毒性分级标准并没有静脉注射方式的标准，但是通过对比其他文献[7]的结果，ITA 的LD50属于较为安全的等级。在实验中，小鼠的死亡都发生在注射后的30 min 内，按照标准的方法观察14 d 未见小鼠继续死亡[7]，由此可见ITA 的毒性会在很短的时间内发作。根据半衰期的长短，可将ITA 归于超快速消除类（t1/2≤ 1 h），这类药物一般不会在机体内大量蓄积，并且会很快被代谢或者排泄出体内[8]。超快速消除类药物要达到作用的血药浓度需要增加给药次数或者使用静脉滴注的方式给药。当机体受到病原体入侵产生炎症时，巨噬细胞在激活的状态下产生ITA[9]，使得体内的ITA 能维持在一定水平。ITA可以由机体细胞产生，所以将来的研究可探索如何刺激体内的细胞产生更多的ITA。

参·考·文·献

[1] Huang XN, Chen M, Li JJ, et al. Establishing an efficient gene-targeting system in an itaconic-acid producing Aspergillus terreus strain[J]. Biotechnol Lett, 2016, 38(9): 1603-1610.

[2] Campe R, Langenbach C, Leissing F, et al. ABC transporter PEN3/PDR8/ABCG36 interacts with calmodulin that, like PEN3, is required for Arabidopsis nonhost resistance[J]. New Phytol, 2016, 209(1): 294-306.

[3] Michelucci A, Cordes T, Ghelfi J, et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production[J]. PNAS, 2013, 110(19): 7820-7825.

[4] Kobayashi EH, Suzuki T, Funayama R, et al. Nrf2 suppresses macrophage inflammatory response by blocking proinflammatory cytokine transcription[J]. Nat Commun, 2016, 7: 11624.

[5] 李雪健, 张谦, 邢玉舒,等. 急性毒性实验的研究进展及缺陷[C]// 中国药物毒理学会.2017 年(第七届)药物毒理学年会论文集.山西.

[6] 李联营. 试分析药物半衰期与合理用药[J]. 中国现代药物应用, 2014, 8(7): 247-248.

[7] 李寅超, 王随华, 郭琰, 等. 冬凌草二萜类成分半数致死量的测定[J]. 中国医院药学杂志, 2011, 31(2): 163-164.

[8] 李大猷. 青霉素静脉滴注的药物动力学及配伍禁忌[J]. 青海医药杂志, 1989, 19(1): 37-39.

[9] Strelko CL, Lu WY, Dufort FJ, et al. Itaconic acid is a mammalian metabolite induced during macrophage activation[J]. J Am Chem Soc, 2011, 133(41): 16386-16389.