基于线粒体标记的滁州鲫遗传多样性和遗传结构

胡玉婷 江河 段国庆 凌俊 潘庭双 周华兴 汪焕

摘 要：为了解滁州鲫遗传种质资源现状，采用线粒体细胞色素b和控制区为分子标记，研究了滁州鲫保种群体和野生群体的遗传多样性和遗传结构。研究获得了长度分别为990bp的Cyt b部分序列和907bp的控制区全序列。2个群体相比较，保种群体遗传多样性略低于野生群体。总体而言，基于线粒体细胞色素b和控制区均显示滁州鲫的遗传多样性偏低，但2个群体在2种分子标记中均不存在显著的遗传分化;不同序列间比较，2个群体的控制区不仅A+T含量更高，还具有更高的单倍型多样性和核苷酸多样性，表明控制区更适于研究滁州鲫的群体遗传变异。

关键词：滁州鲫;细胞色素b;控制区;遗传多样性

中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）24-0012-04

Genetic Diversity and Genetic Structure of Chuzhou Crucian Carp based on Mitochondrial Markers

HU Yuting et al.

（Fishery Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences， Anhui Province Key Laboratory of Aquaculture & Stock Enhancement， Hefei 230031， China）

Abstract： In order to understand the genetic resources of Chuzhou crucian carp， mitochondrial cytochrome b and control region were used as molecular markers to study the genetic diversity and structure of the conserved and wild crucian carp populations. A partial sequence of 990 bp of Cyt b and a full sequence of 907 bp of control region were obtained.  The genetic diversity of the conserved population was slightly lower than that of the wild population， but there was no significant genetic differentiation between the two populations with two molecular markers. In general， the genetic diversity of Chuzhou crucian carp was low with two molecular markers.  The comparison between different sequences showed that the control region not only had higher A+T content， but also had higher haplotype diversity and nucleotide diversity， indicating that the control region was more suitable for studying population genetic variation of Chuzhou crucian carp.

Key words： Chuzhou crucian carp; Mitochondrial cytochrome b; Control region; Genetic diversity

滁州鯽（Carassius auratus），因产于安徽省滁州市滁河而得名，尤其盛产于滁州市西涧湖中[1]，多年来该湖中鲫鱼自然生息繁衍，最高年产量达10000kg，捕捞个体一般在500g以上，最大个体达2kg以上。滁州鲫以个体大，味道鲜美、色泽亮丽深受消费者青睐。早在明朝，《滁州志》就有记载：“滁州西涧鲫鱼因其味美、功能表花，尤脍炙人口;肉肥厚细嫩，味甘香鲜醇、乌背金鳞，银光闪闪，更名闻遐迩”。食者无不赞不绝口，因而价格也远高于一般鲫鱼。20世纪90年代以来，省内外学者开展了滁州鲫相关基础研究，发现滁州鲫是生物进化过程中形成的地方性天然三倍体鲫鱼种群，有雌核发育特性，系全国六大自然三倍体鲫鱼品系之一，具有色泽亮丽、食性杂、生长快、病害少的特点[2-4]，有较高的选育种价值和广阔的推广前景，2017年滁州鲫获批为中华人民共和国地理标志产品，但滁州鲫资源保护不够完善，品种选育还有很大潜力。

近年来，随着滁州鲫养殖规模的不断扩大，对滁州鲫苗种的需求量也越来越大，在实际生产过程中存在种质退化和品种混杂等问题，从而降低了其优良生产性能。而各种自然和人为因素导致其自然栖息地如西涧湖野生资源锐减，从而限制了滁州鲫繁育、养殖产业发展。目前滁州鲫的资源开发利用仅限当地极少数周边地区。究其原因，有关滁州鲫的研究远不够充分，且主要集中在传统的形态学、繁殖、养殖等基础生物学方面[5-9]，对其野生甚至保种群体的遗传多样性和遗传结构现状缺乏研究，限制了滁州鲫的资源保护与开发利用。本研究以滁州鲫保种和原产地西涧湖野生群体为对象，通过采用群体遗传学广泛使用的线粒体细胞色素b和控制区（D-loop）基因为分子标记，分析其遗传多样性和遗传结构，为滁州鲫进一步的种质资源保护和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 2021年6—8月，滁州鲫样品分别采自滁州市农业科学研究院水产科研基地和西涧湖调查样本，测量体重后，每个群体随机取30尾样品鱼，剪取鱼体右侧背部肌肉保存于无水乙醇中备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组的提取、PCR扩增与测序 采用动物基因组提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit），按照提示的操作步骤提取基因组DNA。Cyt b扩增和测序引物均为L14724和H15915[10]，D-loop区扩增引物为CR1和CR2[11]。PCR扩增采用常规方法。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司纯化测序。

1.2.2 序列与群体遗传分析 使用软件Seaview[12]和Bioedit[13]对相關序列进行比对、拼接，并经人工校正。采用软件DNAsp 5.0[14]计算多态位点数目、单倍型数目、单倍型多样性（haplotype diversity，Hd）和核苷酸多样性（nucleotide diversity，Pi）。利用Mega 4.0软件[15]计算序列碱基组成、序列变异率、转换与颠换比值、群体内和群体间遗传距离。由Arlequin 3.5软件[16]计算群体分化指数（Fst）。群体间基因流（Nm）由公式Nm=（1/Fst-1）/2[17]计算得出。

2 结果与分析

2.1 序列分析 经整理后得到长度一致为990 bp的线粒体Cyt b基因同源序列，包括从其起始端第16位至1015位，所有序列无插入和缺失。60条序列共检测到6个多态位点，多态率较低（0.61%），包括简约信息位点4个，单突变位点2个。线粒体Cyt b序列变异主要发生在密码子第3位，仅少数发生在第1位和第2位，且全为同义突变，符合鱼类线粒体中具有较慢的氨基酸变化速率的特征[18]。获得所有样本的线粒体控制区全序列长度一致为907bp，共检测到8个多态位点（多态率仅0.88%），包括简约信息位点7个，单突变位点1个。

基于线粒体Cyt b和D-loop序列的滁州鲫2个群体的碱基组成见表1。相同序列的两群体间碱基组成一致，具有明显的AT偏好（A+T含量57.5%）和反G偏倚（G含量14.0%），符合脊椎动物线粒体基因碱基组成的普遍特征[19]。但Cyt b密码子不同位次上碱基组成差异很大，从第1位的均衡到2、3位碱基G的含量越来越低。而与Cyt b序列比较，控制区具有更明显的AT偏好，A+T含量高达65.4%。

2.2 群体遗传多样性和遗传结构 滁州鲫2个群体的遗传多样性参数见表2。除基于Cyt b的保种群体和总群体的单倍型多样性较低，其他群体单倍型多样性较高（>0.5），基于2个线粒体标记的所有群体核苷酸多样性均较低（<0.01）。而所有群体的核苷酸多样性均较低。2个群体间比较，基于2个标记的野生群体的单倍型多样性和核苷酸多样性均远大于保种群体，显示野生群体遗传多样性高于保种群体。不同标记间比较，基于D-loop区序列的所有遗传多样性参数均明显大于Cyt b序列。

基于线粒体Cyt b和D-loop区的滁州鲫群体间遗传距离均较小（<0.001），且与2个群体内的遗传距离相差不大。基于2个标记的保种群体和野生群体间遗传分化指数Fst均较小（<0.05），显示群体间无显著遗传分化。

3 讨论与结论

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是物种或群体长期进化的产物，也是其生存适应和发展进化的前提，其遗传多样性大小代表生物适应环境变化能力的强弱，既可揭示物种或群体过去的进化历程，也能分析其进化潜力和未来命运。单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi）是衡量群体遗传多样性高低的重要参数，相比较单倍型多样性，核苷酸多样性更能体现遗传多样性的状况。研究结果显示：基于线粒体Cyt b和D-loop2种分子标记的滁州鲫保种群体、野生群体和总群体的单倍型遗传多样性（0.310～0.590）偏低或略高，而核苷酸多样性（0.00045～0.00097）则全部偏低（<0.05）。这表明，滁州鲫的遗传多样性总体偏低，并低于其他地区的鲫鱼群体，如低于基于线粒体COI序列的西江鲫8个群体的遗传多样性（Hd：0.714-0.917，Pi：0.0027-0.0087）[20]、基于线粒体控制区的都柳江鲫的遗传多样性（Hd：0.893，Pi：0.0063）[21]、基于线粒体Cyt b序列和D-loop区野生鲫鱼的遗传多样性（Hd：0.933，Pi：0.00262、0.01127）[22]。滁州鲫遗传多样性较低的原因除了其天然分布范围较窄、野生种群较小的缘故之外，主要是受到人类活动的影响：滁州鲫的主要栖息地西涧湖位于城区边缘，有发电厂利用其水发电，导致西涧湖水位昼降夜升，而鲫鱼把受精卵产于水草，但由于白天水位下降且气温升高使其难以孵化。

滁州鲫保种群体遗传多样性低于野生群体，可能与奠基者效应导致的种群遗传多样性水平较低有关。这种保种或养殖群体遗传多样性低于野生群体的现象在许多鱼类研究中均有报道，如欧阳美等[23]基于线粒体Cyt b基因序列对长江中上游草鱼野生和养殖群体遗传多样性进行了比较研究，结果显示草鱼群体多样性水平大小依次是：野生群体>原种场群体>苗种场群体>放流群体。为提高保种群体的遗传多样性，可加大从野生群体采集更多单倍型个体，更新保种群体亲本。

基于2种分子标记的滁州鲫单倍型间最大变异率很低（0.61%、0.88%），显示为种内级别的差异。与线粒体Cyt b序列比较，两群体的控制区不仅A+T含量更高，还具有更高的单倍型多样性和核苷酸多样性，表明控制区更适于研究滁州鲫的群体遗传变异。群体遗传结构上，当遗传分化指数Fst在0至0.05 间为无分化，0.05至0.15 间为中度分化，0.15至0.25 间为高度分化[23]。基因交流程度是影响群体遗传结构的重要因素，当群体间基因流Nm≥4时，基因流则成为主导因素，可防止群体间遗传漂变[24]。本研究基于Cyt b序列和D-loop的滁州鲫两群体间遗传差异分析结果中Fst均小于0.05、Nm均远大于4，表明2个群体间基因交流频繁、遗传差异较小，群体间无显著遗传分化。这可能与保种群体均取自野生群体并定期更新有关，保种群体繁育的后代放流到西涧湖，因而2个群体间存在定期的基因交流，遗传差异不明显。

综上，滁州鲫群体包括保种群体和野生群体的遗传多样性较低，保种和野生群体间无显著遗传分化，但保种群体遗传多样性略低于野生群体，可通过从野生群体采集更多单倍型个体更新保种群体进而提高其遗传多样性水平，研究可为滁州鲫的资源保种和开发利用提供科学依据。

参考文献

[1]张克俭，万全，李公行，等.滁州鲫的形态学和血清蛋白电泳谱型[J].水产学报，1996，20（4）：352−356.

[2]张克俭，万全，李公行，等.滁州鲫染色体组型的研究[J].中国水产科学，1995，2（4）：8−15.

[3]徐广友，万全，袁兆祥，等.滁州鲫雌核发育的细胞学研究[J].安徽农业大学学报，2009，36（4）：533−537.

[4]尹永波，崔迎松，彭福，等.滁州鲫生物学特性及其苗种培育技术[J].中国水产，2005，（4）：43.

[5]马明发，张克俭，凌武海，等.三种群银鲫形态特征的比较研究[J].河北渔业，2009（4）：17−19.

[6]马明发，袁兆祥，凌武海，等.滁州鲫生长特性的初步研究[J].水产养殖，2010，31（5）：16−20.

[7]袁兆祥，凌武海，汪永忠，等.滁州鲫鱼人工繁育与苗种培育技术研究[J].水产养殖，2010，31（3）：2−4.

[8]凌武海，任信林.天然滁州鲫氨基酸成分分析与营养价值评价[J].水产养殖，2011，32（1）：50−52.

[9]陈可东，万全，蔡玉龙.滁州鲫夏花鱼种适宜蛋白质需求量的研究[J].水利渔业，2004，24（2）：23−24.

[10]Xiao W H，Zhang Y P，Liu H Z. Molecular systematics of Xenocyprinae （Teleostei：Cyprinidae）：Taxonomy，biogeography，and coevolution of a special group restricted in East Asia[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2001，18（2）：163−173.

[11]刘良国，杨品红，王文彬，等.洞庭青鲫与其他六个鲫鱼群体线粒体DNA控制区的比较分析[J].水生生物学报，2010，34（2）：378−38.

[12]Galtier N，Gouy M，Gautier C. SeaView and Phylo_win：two graphic tools for sequence alignment and molecular phylogeny[J]. Computer Applications in the Biosciences，1996，12：543−548.

[13]Hall，T.A. BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT [J]. Nucleic Acids Symp Ser，1999，41：95−98.

[14]Librado P，Rozas J. DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data [J]. Bioinformatics，2009，25：1451−1452.

[15]Kumar S，Dudley J，Nei M et al. MEGA：A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences [J]. Briefings in bioinformatics，2008，9（4）：299−306.

[16]Excoffier L，Lischer HEL. Arlequin suite ver 3.5：A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows [J]. Molecular Ecology Resources，2010，10：564−567.

[17]Hudson RR，Slatkint M，Maddison WP. Estimation of levels of gene flow from DNA sequence data [J]. Genetics，1992，（132）：583−589.

[18]Kocher TD，Thomas WK，Meyer A. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals：amplification and sequencing with conserved primers [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1989，86：6196−6200.

[19]Cantatore P，Roberti M，Pesole G，et al. Evolutionary analysis of cytochrome b sequences in some perciformes：Evidence for a slower rate of evolution than in mammals[J]. Journal of Molecular and Evolution，1994，39（6）：589?597.

[20]匡天旭，帅方敏，陈蔚涛，等.西江鲫的遗传多样性与群体结构[J].南方水产科学，2018，14（5）：29−35.

[21]袁振兴，代应贵，刘伟，等.都柳江鲤、鲫和草鱼种群mtDNA控制区及遗传多样性分析[J].基因组学与应用生物学，2017，36（5）：1926−1934.

[22]邓朝阳.鲫4个群体线粒体Cytb序列和D-loop区的比较分析[J].现代农业科技，2015，（9）：277−279，283.

[23]欧阳美，张晓宇，张富铁，等.基于线粒体Cytb基因序列的长江中上游草鱼野生和养殖群体遗传多样性比较研究[J].淡水渔业，2021，51（4）：65−74.

[24]Wright S. Evolution and the genetics of populations. vol. 4. Variability within and among natural populations [A].University of Chicago Press， Chicago. 1978， 580.

（责编：王慧晴）