不同温光条件对海岛棉愈伤组织诱导的影响

孙 阳 李 欣 胡超越

（塔里木大学生命科学学院/新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

新疆作为海岛棉的主要生产区，因气候、环境、土壤等特点，需要培育抗盐、抗旱、耐高温的品种，通过转基因技术改良海岛棉品种对新疆盐渍化的适应性，是一种快速有效的手段，而这需要组织培养技术支持，因此海岛棉稳定再生体系的建立尤为重要[1-2]。目前，棉花组织培养、转基因的研究棉种主要是陆地棉[3]、克劳茨基棉[4]等。本研究的棉种是海岛棉，是目前所报道的可以再生的棉花品种中较难再生的一种，存在胚状体萌发率偏低、畸形苗率较高[5]、再生周期长[6]、生根困难[7]、缺少内源激素含量水平与最适外源激素浓度之间的关系探讨[8]等问题。

在植物组织培养中，培养温度、是否光照等因素对愈伤组织诱导有不同的影响。这些差异会导致外植体生理生化状态差异，从而影响组织培养的形态发生。本研究以3个新疆主栽海岛棉品种的下胚轴为外植体，设置不同温度、光照条件，分析不同条件对海岛棉品种愈伤组织形态、出愈率等的影响，为建立海岛棉高效再生体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆海岛棉品种：新海21、新海40、新海44，均由新疆阿拉尔市种子市场购买。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

选取3个新疆海岛棉品种在3种光照（全光照、交替光照、全黑暗）、2种温度（25℃、28℃）条件下诱导愈伤组织形成，重复3次。观察比较愈伤组织形成快慢、大小、颜色、质地等形态特征，并统计出愈率。试验采用双因素完全随机设计。

1.2.2 测定项目及方法

选取成熟饱满的海岛棉种子，每个品种的海岛棉种子各取50粒，在超净工作台上用无菌水冲洗1次，75%乙醇溶液消毒30 s，无菌水冲洗1次，用2%次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗3次。待种子干燥后接种于装有1/2 MS培养基上，每瓶培养基上接种4～5粒种子，移入培养室中，置于28℃下全光照培养，以期获得7 d的无菌苗备用。

选取健康幼苗下胚轴，在超净工作台上切成0.8～1 cm大小的段作为外植体，接种于MS（4.74 g/L MS培养基+30 g/L葡萄糖+7.5 g/L琼脂粉）、辅以激素0.1 mg NAA+0.1 mg KT的愈伤组织诱导培养基上。激素均在灭菌前加入培养基，pH 6.5，121℃高压灭菌20 min。每个处理接种10～12个外植体，重复三次。培养温度为25℃、28℃，光照设置参考黄莉雅[9]略作调整，设置光照培养、光照黑暗交替培养（光照2周+黑暗2周交替处理）、黑暗培养，光照强度1 500～2 000 Lx。

持续观察愈伤组织的生长量，愈伤组织的颜色及类型和疏松愈伤组织细胞形态，并统计25 d出愈率：

愈伤组织出愈率（%）=（形成的愈伤组织数/接种的外植体数）×100。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和DPS（9.01）软件对愈伤组织诱导培养结果进行统计分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 不同培养条件对海岛棉愈伤组织形态的影响

本试验设置不同温度、光照条件对3个海岛棉品种进行愈伤组织诱导，结果表明：3个海岛棉品种愈伤组织颜色以黄绿色、绿色为主，其次为黄色，质地多为疏松（图1，A-F）。在25℃、全光照条件下，新海21愈伤组织颜色则为黄色质地疏松（图1，E）；25℃、交替光照条件下，新海40、新海44愈伤组织颜色多为白色、少数为绿色，且质地多为疏松部分质地紧致（图1，F、I）。在28℃、全光照条件下，新海21愈伤组织为黄绿色质地疏松（图1，D）；28℃、交替光照条件下，新海21、新海40愈伤组织颜色以白色为主、部分为绿色，且质地多为疏松（图1，G、H）。25℃和28℃黑暗条件下进行愈伤组织诱导，新海21诱导出愈伤组织均为白色且质地疏松（图1，N、O），新海40则两端呈黑色，未出现愈伤组织（图1，J、K）。通过以上分析，新海21相比新海40和新海44在不同的温光条件下更容易形成颜色和质地较优的愈伤组织。

图1 海岛棉愈伤组织颜色、形态

2.2 不同温度对愈伤组织形成的影响

在全光照、交替光照条件下，3个海岛棉品种在不同温度条件下愈伤组织形成速度不同，28℃培养温度出愈时间较早，9天左右即肉眼可见明显愈伤组织，愈伤组织主要发生在外植体两端，颜色多为绿色（图1，A）。25℃培养温度出愈时间较晚，11天左右即肉眼可见明显愈伤组织，颜色多为白、绿色（图1，B、C）。从愈伤组织形成快慢、形态等方面观察，在光照条件一定的情况下，28℃对海岛棉愈伤组织生长速度有一定的促进作用，形成的愈伤组织颜色、质地更优于25℃培养条件。

将相同光照条件下3个海岛棉品种在2种温度下的出愈率进行差异显著性分析。全光照条件下（图2，A），新海21、新海40在2种温度下的出愈率差异显著；新海44在2种温度下的出愈率差异未达到显著水平。交替光照条件下（图2，B），新海21在2种温度下的出愈率差异显著，而新海40、新海44在2种温度下出愈率差异不显著。在黑暗条件下（图2，C），3个海岛棉愈伤组织诱导效果较差，只有新海21形成愈伤组织，在28℃和25℃条件下出愈率分别为12.22%、11.94%，新海40、新海44在2种温度下出愈率均为0。3个海岛棉品种2种温度下的出愈率差异均表现不显著。

通过以上分析，相比较新海40、新海44，新海21在相同光照条件下诱导愈伤组织对温度比较敏感，3个海岛棉品种在28℃时诱导愈伤组织形成较快、质地较好。

图2 相同光照条件下2种温度出愈率比较

2.3 不同光照对愈伤组织形成的影响

全光照条件下，海岛棉以黄绿色、绿色愈伤组织为主，比交替光照条件下形成的愈伤组织多，且形成快（图1，A-E）。交替光照条件下出现了白色的愈伤组织，质地多为紧致（图1，F-I），黑暗条件下新海40、44未形成愈伤组织，新海21形成少量愈伤组织，出愈率明显低于全光照培养和交替光照培养，且差异达到显著水平。黑暗条件外植体容易诱发根毛生长，愈伤组织多为白色，外植体两端呈现黑色（图1，J-O）。

在温度一定的情况下，对3个海岛棉品种不同光照条件下出愈率进行差异显著性分析（见图3）。在温度为28℃时（图3，A），3个海岛棉品种全光照和交替光照出愈率差异均不显著，但与黑暗条件下出愈率差异达到显著水平。温度为25℃时（图3，B），新海21在全光照、交替光照、黑暗条件下出愈率间差异均达到显著水平；新海40交替光照出愈率高于全光照，新海44则相反，但出愈率差异均不显著，新海40和新海44在全光照、交替光照条件下出愈率与黑暗条件下出愈率差异达到显著水平。通过以上分析，光照对海岛棉愈伤组织形成及形态、颜色、出愈率等影响较大。本试验3个海岛棉品种出愈率在全光照、交替光照下多数表现出为差异不显著；综合愈伤组织形态观察，全光照较交替光照更有利于愈伤组织形成；黑暗条件下愈伤组织形态较差或未形成愈伤组织，即不利于海岛棉愈伤组织的形成。

图3 相同温度条件下3种光照出愈率的比较

2.4 不同基因型对愈伤组织形成的影响

3个品种海岛棉形成以黄色、黄绿色、绿色为主，质地多为疏松的优质愈伤组织（图1，A-E）。在相同温度、光照条件下，新海21愈伤组织以黄色、质地疏松为主，生长速度较快，愈伤组织成块较大；新海40和新海44愈伤组织以绿色、质地紧致为主，生长速度较慢，愈伤组织成块较小（图1）。

在全光照和交替光照条件下，3个海岛棉品种（基因型）在2种温度下均可以形成愈伤组织，但出愈率不同，黑暗条件下，只有新海21形成少量愈伤组织（图4）。在光照和温度一致的条件下，对3个品种（基因型）的海岛棉出愈率进行差异显著性分析。在28℃（图4，A）时，全光照条件下，新海21出愈率低于新海40、新海44的出愈率且差异显著；交替光照条件下，3个品种的出愈率差异不显著；黑暗条件下，新海40、新海44的出愈率为0，且与新海21的出愈率差异达到显著水平。在25℃（图4，B）时，全光照条件下，新海40的出愈率低于新海21、新海44的出愈率且差异显著；交替光照条件下，新海21出愈率低于新海40、新海44的出愈率且差异显著；黑暗条件下，新海40、新海44出愈率为0且与新海21的出愈率差异达到显著水平。通过以上分析，3个海岛棉品种在相同条件下诱导的愈伤组织形态、出愈率表现不同。新海21出愈率与新海40、新海44出愈率差异大部分达到显著水平，而新海40和新海44出愈率差异大部分表现不显著。说明基因型对海岛棉愈伤组织形态、愈伤组织诱导快慢、出愈率等均有一定的影响。

图4 相同温度、光照条件下3个品种出愈率的比较

3 结论与讨论

植物组织培养中，光温条件是影响生长发育的关键因子，不同的培养条件对海岛棉愈伤组织发生及形态的影响有较大差异。本研究以海岛棉新海21、40、44下胚轴为外植体材料，愈伤组织诱导阶段在培养基中添加0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT时，出愈率可达90.26%～97.31%，愈伤组织颜色以黄绿色、绿色为主，质地多为疏松，黑暗条件下新海40、新海44未形成愈伤组织。3个品种愈伤组织培养可能更适应温度为28℃、全光照的培养条件。

（1）李占岐等[10]人研究表明“湘棉-18”茎尖培养时，最适培养温度为26℃～29℃，低于24℃愈伤组织生长缓慢，不利于植株生长发育。顾冉冉等[11]、师海荣等[12]研究结果为新陆早33及百棉1号愈伤组织诱导温度均为（28±1）℃。本试验结果表明28℃相比于25℃更有利于海岛棉新海21、40、44形成愈伤组织，这与以上研究结果基本一致。

（2）光照能够诱导植物组织形态的建成，影响离体培养细胞的增殖和器官的分化，对外植体细胞最初分裂的影响更为显著[13]。本研究结果显示，在暗培养条件下海岛棉愈伤组织诱导阶段出愈率明显低于光照培养和交替培养，这与刘艳等[14]人研究紫苏愈伤组织诱导结果基本一致。李占岐等[10]人研究表明，暗培养的“湘棉-18”外植体比光照下的易形成愈伤和胚状体，而且光照对生根的影响较大。而本研究中黑暗条件对海岛棉新海21、40、44的愈伤组织的形成有一定的抑制作用，抑制原因有待进一步研究，但本实验中海岛棉黑暗条件外植体容易诱发根毛生长这与李占岐等人研究结果相似。本试验结果显示交替培养虽然出愈率与全光照培养相差不大，但是诱导效果不及全光照培养，颜色质地差异较大，可能是光照对海岛棉愈伤组织某些酶活性和叶绿体代谢产物存在一定影响，从而影响愈伤组织色素合成。前人研究发现，新陆早33、45、50及柯字棉312先暗处理后光处理更有利于棉花下胚轴愈伤组织发生[15-16]。这可能是不同的植物组织生长、发育受光照的调节机制不同所致[17]。本研究未对先黑暗后光照、一天内光照交替条件下愈伤组织诱导效果进行研究，并且光处理时光强、光质、光周期对海岛棉愈伤组织形成的影响，也有待进一步探讨。

（3）在不同温度、光照条件下诱导的海岛棉愈伤组织表现不同，除了温度、光照对愈伤组织形态、愈伤组织形成快慢、出愈率有着不同程度的影响，还可能存在基因型与之互作，本试验的3个海岛棉品种（基因型）数量少，不同基因型与温度、光照对愈伤组织形成的影响是否存在互作、互作大小等，还需要对更多不同基因型海岛棉进行深入地研究。