两种紫苏挥发油体外抑菌效果评价

2021-01-13褚宏叶杨仕梅商志伟温贺赵德刚沈奇

山地农业生物学报 2021年5期

褚宏叶　杨仕梅　商志伟　温贺　赵德刚　沈奇

摘要：紫苏挥发油广泛用于食品及医药行业。为了探究紫苏醛及紫苏烯两种化学型紫苏挥发油的抑菌活性，本研究采用水蒸气蒸馏法对紫苏叶挥发油进行提取，采用GC-MS对挥发油成分进行鉴定，并采用滤纸片法进行体外抑菌活性评价。结果表明，供试两种紫苏挥发油分别含有59.71 mg/mL紫苏醛及42.25 mg/mL紫苏烯。抑菌试验显示两种紫苏挥发油均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌三类细菌均有明显的抑制活性。尤其是对沙门氏菌抑制作用，可达到和对照抗生素相似的效果，低浓度即可达到良好抑制效果。研究结果表明，两种紫苏挥发油有具有良好的抑菌效果，可作为天然的抑菌剂进行应用。

关键词：紫苏;挥发油;抑菌活性

中图分类号：R285.5 文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2021）05-0034-06 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.05.006

Evaluation of the Antibacterial Effect of Two Perilla Essential Oil in Vitro

CHU Hongye1，2，3，YANG Shimei1，SHANG Zhiwei3，WEN He3，ZHAO Degang1，3，SHEN Qi1，2*

（1.College of Life Sciences，Guizhou University/Agricultural Bioengineering Research Institute/Key Laboratory of Mountain Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation，Ministry of Education/Key Laboratory of Agricultural Bioengineering of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.Guangzhou Universityof Chinese Traditional Medicine，Institute of Physiology and Ecology of Medicinal Plants，College of Chinese Materia Medica，Guangzhou，Guangdong 510006，China;3.Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang，Guizhou 550008，China）

Abstract：Perilla volatile oil is widely used in the food and pharmaceutical industries.In order to explore the antibacterial activity of volatile oil of two chemical type，sperilla aldehyde and perillene，in this study，steam distillation was used to extract the volatile oil from perilla leaves，andgas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） was used to identify the chemical components of volatile oil，and then the filter paper method was used to evaluate the antibacterial activity in vitro.The results showed that the two Perilla volatile oils tested contained 59.71 mg/mL perillaldehyde and 42.25 mg/mL perillene.Antibacterial test gainst displayed that E.coli，Staphylococcus aureus，Salmonella bacteria were significant inhibited，In particular，the inhibitory activity on Salmonella could achieve a similar effect to that of the control antibiotic，and a low concentration could achieve a good inhibitory effect.The research results showed that the two kinds of perilla volatile oil had good antibacterial effects and could be used as natural antibacterial agents.

Keywords：Perilla frutescens;volatile oil;antibacterial activity

基金项目：国家自然科学基金项目（31860391）;省优秀青年科技人才项目（黔科合平台人才[2019]5656）;贵州省科研机构创新能力建设专项资金项目（黔科合服企[2021]13）

紫苏（Perilla frutescens），古名荏，又名引子、苏子、白苏、苏麻、香苏、苏草及桂芢等，是唇形科紫苏属 1 年生草本植物。主要分布于中国的江苏、湖北、广东、广西、河南、贵州、四川、韩国、日本等亚洲地区[1]。紫苏是我国传统的药食两用植物，全株均可入药[2]。其中，紫苏叶具有解表散寒，宣肺化痰，行气和中，主要用于感冒风寒，咳嗽妊娠呕吐，鱼蟹中毒[3]。紫苏叶香气浓厚，源于其中丰富的挥发油类物質。《中华人民共和国药典》规定，紫苏叶以挥发油不得少0.40%为主要特征成分[4]。紫苏叶挥发油具有良好的抗氧化、防衰老、增强免疫力、抑菌抗炎及抑制肿瘤细胞增长的功效[5]，因此在食品、药品、化妆品、香料等领域均有广泛应用。紫苏叶挥发油成分主要为单萜类，倍半萜类，苯丙素类和呋喃酮类等物质。根据不同的主要单萜物质，可将紫苏分为多种化学型，如以紫苏醛（perillaldehyde）为主要成分的PA型，以紫苏烯（perillene）为主要成分的PL型等[6-7]。不同化学型主效成分含量不同，功能和应用必然存在差异。近年来，由于良好的抑菌及抗氧化活性，紫苏叶挥发油在日化用品及护肤品中应用显著增加[8]。有关紫苏挥发油的研究已有不少报道，但对于不同化学型的紫苏叶挥发油活性研究报道较少。因此，本研究以紫苏中两种主要的化学类型：紫苏醛和紫苏稀型挥发油，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等细菌的抑菌活性进行考察，可为紫苏挥发油的应用开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

紫苏醛型及紫苏烯型紫苏材料为课题组前期收集并鉴定的种质资源。2018年种植于贵州省农业科学院实验基地。4月中旬播种，5月中旬定植，种植密度为5500 株/667m2，正常水肥管理。花前期收获紫苏叶片，阴干干燥，用于挥发油提取。

试验菌株大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为课题组保藏菌株。紫苏醛、紫苏烯标准品均购于武汉天植。

1.2 方法

1.2.1 紫苏挥发油的提取

采取水蒸汽蒸馏法提取挥发油[9-11]，取干燥紫苏叶粉碎，过65目筛。500 mL蒸馏水加入50 g紫苏粉末，连接蒸馏装置，蒸馏5 h，收集油相液体。收集液体加入 10 mL 的石油醚进行萃取，去掉下层水相，连续萃取 2～3次，合并萃取液。在萃取液中加入适量的无水硫酸钠去除掉残留水份，4 ℃过夜，将滤液旋转蒸发 5 min 去掉石油醚，即得到供试所需紫苏挥发油。

1.2.2 挥发油成分测定

取供试挥发油用甲醇稀释1000倍，采用GC-MS检测成分。气相条件：RXT-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 μm×0.25 μm）;柱前压为63.9 kPa;不分流;进样量为500 μL;进样口温度为260 ℃;载气为He;柱初温为80 ℃，保留1 min，再经过15 ℃/min的升温速率，升至300 ℃，保留15 min。完成一个样品检测时间为31 min。MS条件：电离方式为EI，灯丝电流0.5 mA;电子能量70 eV;倍增器电压0.86 kV;离子源230 ℃，溶剂延迟1 min;质核比m/z：40～500。结果根据安捷伦定性软件检索NIST谱图库，结合人工化学结构解析判定，鉴定成分种类。由峰面积归一法计算挥发油各化学成分的相对百分含量。并根据紫苏醛、紫苏烯挥发油标准品比较，计算绝对百分含量。

1.2.3 菌株的活化及制备

用划线法将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌接种于LB固体培养基中， 37 ℃培养24 h。分别取上述菌株的新鲜培养物，分别取不同的菌种置于LB液体培养基中，摇床振荡培养至OD值为0.6备用。

1.2.4 体外抑菌试验

将定性滤纸用打孔机打成直径为0.6 cm的圆形纸片[12]，高压灭菌备用。紫苏挥发油分别稀释为60%，80%及100%的溶液备用。分别吸取0.1 mL培养菌液（OD=0.6）放入LB固体培养基中，均匀涂布，静置5 min。将平板均分为6个区域[13]，分别取灭菌纸片放入不同浓度紫苏挥发油溶液中浸润，然后均匀间隔贴于培养基表面，轻压使之接触良好。以无菌水作阴性对照，以卡纳霉素（1 g/L），头孢霉素（5 g/L）作阳性对照。37 ℃恒温培养24 h后，观察抑菌圈直径大小，用直尺进行测量并記录结果，试验设置3次重复，求其平均值。

2 结果与分析

2.1 紫苏挥发油成分定性分析

采用水蒸气蒸馏法提取紫苏挥发油，获得两种类型挥发油采用GC-MS检测成分。紫苏醛、紫苏烯挥发油总离子流图见图1。紫苏醛型样品挥发油检测，其中含有紫苏醛，石竹烯，等单萜类成分，其中紫苏醛相对含量为71.98%，采用标准品定量分析，其绝对含量为59.71 mg/mL。紫苏烯型样品挥发油检测，其中含有紫苏烯，柠檬醛等单萜类成分，其中紫苏烯相对含量为90.76%，采用标准品定量分析，绝对含量为42.25 mg/mL。

2.2 紫苏醛挥发油抑菌活性分析

紫苏醛型挥发油对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验可以看出，不同浓度的紫苏醛型挥发油均对三类菌有显著的抑制效果（图2）。为探究不同浓度紫苏醛挥发油对三类菌抑制作用是否存在显著差异，试验采用单因素方差法对测量数据进行分析。运用 SPSS Statistics 25.0 对不同浓度紫苏醛挥发油抑菌圈大小均值进行单因素方差分析（表2），由表可知不同浓度紫苏醛挥发油对大肠杆菌抑制作用之间差异不具有统计学意义。60%浓度与100%浓度紫苏醛挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制作用相比存在显著性差异，具有统计学意义（P=0.012<0.05），且100%紫苏醛挥发油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用优于60%紫苏醛挥发油。60%浓度与80%、100%浓度紫苏醛挥发油对沙门氏菌抑菌作用相比存在显著性差异，具有统计学意义（P=0.012<0.05、P=0.006<0.05），且100%紫苏醛挥发油对沙门氏菌抑制作用优于80%紫苏醛挥发油。紫苏醛型的紫苏挥发油对沙门氏菌抑菌效果优于阳性对照头孢霉素及卡纳霉素，对沙门氏菌抑菌效果非常好。2.3 紫苏烯挥发油抑菌活性分析

紫苏烯型紫苏挥发油对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果可以看出，不同浓度的紫苏烯型挥发油均对三类菌有一定的抑制效果（图3）。为探究不同浓度紫苏烯挥发油对三类菌抑制作用是否存在显著差异，试验采用单因素方差法对测量数据进行分析。运用 SPSS Statistics 25.0 对不同浓度紫苏烯挥发油抑菌圈大小均值进行单因素方差分析（表3），由表可知60%浓度与100%浓度紫苏烯挥发对大肠杆菌抑菌作用相比差异显著，具有统计学意义（P=0.014<0.05），且100%紫苏烯挥发对大肠杆菌抑菌作用优于60%紫苏烯挥发油。60%浓度与100%浓度紫苏烯挥发油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用相比存在显著性差异，具有统计学意义（P=0.013<0.05），且100% 注：不同浓度的紫苏烯型挥发油对大肠杆菌（E.coil）的抑制效果（a.柱状图，b.抑菌平板照片）。不同浓度的紫苏烯型挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制效果（c.柱状图，d.抑菌平板照片）。不同浓度的紫苏烯型挥发油对沙门氏菌的抑制效果（e.柱状图，f.抑菌平板照片）。

紫苏醛挥发油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于60%紫苏醛挥发油。不同浓度紫苏烯挥发油对沙门氏菌的抑菌作用之间差异不具有统计学意义。

2.4 紫苏醛与紫苏烯挥发油抑菌活性差异分析

为探究两种化学型紫苏挥发油对三类菌抑菌效果是否存在显著差异，试验采用独立方差分析法对测量数据进行分析。运用 SPSS Statistics 25.0对两种紫苏挥发油对三类菌抑菌圈大小均值进行独立样本T检验（表4），由表可知两种紫苏挥发油对三类菌抑菌效果之间差异不具有统计学意义（P>0.05）。

3 结论与讨论

紫苏原产于中国，是我国传统的药食两用植物，在我国有着非常悠久的应用历史。我国也是世界上紫苏栽培及出口量最大国家，目前20多个省均有紫苏野生及栽培报道[14]。紫苏叶挥发油可作为香料应用于香水中，作为芳香药物用于芳香疗法中，作为调味剂和防腐剂加入食物中，作为保健品调理人体机能，作为抗衰老成分用于护肤品中，根据紫苏叶挥发油的药理活性可预测将来有望将其开发成潜在的新型消炎抗菌药、抗肿瘤药、抗抑郁药及降压药等药物用于减轻人类病痛，也可将其开发成天然的农药[15]。目前，紫苏叶精油已广泛用于保健品及化妆品行业，研究开发及经济价值已倍受国内外的广泛关注。对紫苏中挥发油类、黄酮类、酚酸类及萜类化合物的提取鉴定及其抗炎抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生物学活性作用研究较多[16]，对于不同化学型紫苏挥发油研究尚有不足，本文对于两种不同化学型紫苏挥发油紫苏醛型与紫苏烯型，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌活性进行研究。

大肠杆菌为革兰氏阴性短杆菌是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染[17]。金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，为典型的革兰氏阳性菌，可引起人和动物的感染，也是导致食物中毒比较常见的食源性细菌，可以引起人和动物多种感染，如人的一般皮肤感染、食物中毒到甚至危及生命的疾病[18]。沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，传播范围比较广，一般寄生在人体和动物体内，引致人畜发生伤寒、败血症、胃肠炎以及腹泻等病症[19]。这三种细菌均与人和动物的生活息息相关。研究结果表明：紫苏醛型挥发油和紫苏烯型挥发油对三类菌均良好的抑菌效果，其中紫苏醛型挥发油浓度改变对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑制作用影响明显，尤其是对沙门氏菌，60%浓度时与80%浓度时抑菌效果存在差异显著，对大肠杆菌抑制作用影响不明显。紫苏烯挥发油浓度改变对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制作用影响明显，均在浓度100%时抑菌效果较好，对沙门氏菌抑制作用影响不明显，较小浓度紫苏烯挥发油对沙门氏菌就能达到较好的抑制作用。通过对两种紫苏挥发油抑菌效果作比较，发现两种紫苏挥发油对三类菌的抑制作用没有明显差异，均具有良好的抑制作用，说明两类紫苏挥发油均可以作为天然的抑菌剂，用于日化产品的开发。目前已有报道，紫苏叶挥发油具有良好的抗氧化、防衰老、增强免疫力、抑菌抗炎及抑制肿瘤细胞增长的功效[20]，可作为医疗工程、香料工程原料及工艺品进行开发利用，在天然抑菌剂和日化用品及护肤用品的应用前景也非常广阔。本研究为紫苏的后续开发利用提供理论支撑。

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