适配体传感器在肿瘤标志物检测中的研究进展

周 倩, 卢明华

(河南大学 化学化工学院, 河南 开封 475004)

肿瘤标志物是肿瘤细胞本身存在或者由肿瘤细胞异常表达所产生的一类物质，常常存在于血清、细胞、尿液、体液或组织中，其含量变化可用于恶性肿瘤的诊断、疗效的评估、复发及预后的判断[1-3].肿瘤标志物检测具有敏感性强、操作便捷、非侵入性以及价格低廉等优点，对于肿瘤的预防、早期诊断、疾病监测和预后判断等具有重要作用，可有效弥补其他医学技术对肿瘤诊断、治疗及预后判断的不足.目前用于肿瘤标志物检测的分析方法主要包括免疫分析法和生物传感技术.免疫分析方法操作简单，但检测耗时较长且实验结果误差较大[4].生物传感器通过分子识别元件对目标物质进行特异性识别，并通过理化换能器和信号放大装置将生物信号转变为易于检测的信号，具有特异强、实时输出、设备简单等优点[5-7].分子识别元件的结合特性对于生物传感器的分析性能有重要影响.其中，抗体和酶是经典的生物传感识别元件，特异性强，但存在热稳定性差、制备纯化成本高昂等问题.

近年来，核酸适配体作为一种新的分子识别元件，为生物传感器的发展注入了新的活力.核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的一段特定核酸序列，能够折叠成各种二级结构和三级结构，并通过范德华力、氢键、形状匹配以及碱基堆积等作用特异性地识别并结合生物分子、细胞等目标物质[8-11].与传统的抗体识别相比，核酸适配体不仅具有良好的特异性及强的亲和力，还体现出一些独特的优势[12-14]：理论上，通过SELEX技术能够得到针对不同靶标的适配体序列，其目标物质包括离子、小分子、蛋白质以及细胞等，识别范围更广；其次，适配体具有良好的化学稳定性，不易受pH以及温度等环境因素的影响而变性，且能够实现可逆的变性与复性；此外，其能够通过化学合成，制备简单，价格低廉，且易于修饰和标记.基于上述优势，核酸适配体作为生物识别元件已广泛应用于生物分析、疾病诊断和癌症治疗等方面.

目前，已经通过筛选技术获得癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和前列腺特异性抗原(PSA)等多种肿瘤标志物的核酸适配体序列，基于核酸适配体的肿瘤标志物检测方法也逐渐引起研究者们的关注.本文对近年来适配体传感器在肿瘤标志物检测中的研究进展进行综述，并对该领域面临的挑战和发展前景进行展望.

1 荧光适配体传感器

荧光适配体传感器是将核酸适配体作为生物识别元件，通过适配体与肿瘤标志物的特异性结合引起检测体系荧光信号的变化，从而实现对待测物的定性和定量分析.根据适配体与荧光基团的作用方式，可将荧光适配体传感器分为标记型和非标记型两大类.

标记型荧光适配体传感器通常将荧光基团修饰在适配体的末端或者活性位点，通过适配体与目标物结合后发生的构象变化，改变荧光基团与猝灭剂的相对位置，从而引起检测体系荧光强度的变化.ZHAO等[15]将荧光团标记的适配体作为信标探针，利用MoS2纳米片对单链适配体的吸附作用以及优异的荧光猝灭能力构建了一种荧光适配体传感器用于癌胚抗原(CEA)的检测.适配体与目标物结合后发生构型转变，与MoS2纳米片分离，被猝灭的荧光信号得到恢复.该传感器在0.1～100 μg·L-1浓度范围内对CEA表现出良好的信号响应，检测限为 34 ng·L-1.随着纳米技术的发展，金属纳米簇、量子点等性能优异的荧光纳米材料被开发并应用于荧光适配体传感器的构建.FANG等[16]采用CdSe/ZnS量子点作为荧光材料用于适配体的标记，并结合氧化石墨烯(GO)纳米片构建了基于目标物循环信号放大的荧光传感器用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测.该传感器在0.1～3 pg·L-1浓度范围内对PSA表现出良好的线性响应关系，检测限为0.05 pg·L-1.XU等[17]合成了绿色和红色两种发射波长的金纳米簇，并将其分别作为甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)适配体的荧光标记材料，构建了同时检测AFP和CEA的荧光适配体传感器.对不同肿瘤标志物的适配体标记不同发射波长的荧光材料，可实现多种肿瘤标志物的联合检测，有效避免假阳性检测结果的出现.

与标记型相比，非标记型适配体传感器的构建不需要繁琐耗时的探针标记和纯化步骤，且能有效降低传感器制备的批间差异.CHEN等[18]基于适配体构建了一种即时生成铜纳米簇的无标记荧光适配体传感器用于CEA的检测.没有目标物存在的情况下，适配体与辅助互补链形成双链结构，作为模板用于铜纳米簇的形成，产生较强的荧光信号；目标物CEA存在的使得适配体无法形成双链DNA结构，荧光铜纳米簇无法生成，导致荧光信号减弱，该方法检出限低至0.006 5 μg·L-1.CHEN等[19]利用荧光物质硫磺素T(ThT)与末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导生成的G-四链体结合，使荧光强度增强来检测PSA，该方法在0.1～80 ng·L-1的浓度范围内对PSA有良好的信号响应，检出限为0.086 ng·L-1.为了进一步提升传感器的灵敏度，LI等[20]在传感器的构建过程中引入杂交链式反应(HCR)进行信号放大，基于CdZnTeS量子点构建了一种荧光适配体传感器用于肿瘤标志物MUC1抗原的特异性检测.该方法利用目标物与适配体片段的结合打开发夹DNA链，并触发HCR反应形成长的DNA双链，大量猝灭剂嵌入其中，量子点的荧光信号得到恢复，从而实现对目标物MUC1的高灵敏检测.QIU等[21]设计了介孔二氧化硅(MSN)控制释放体系用于信号放大，封闭孔道的适配体与目标物结合后从MSN上分离，装载在介孔孔道中的葡萄糖分子被释放出来并被孔道外的葡萄糖氧化酶氧化，生成过氧化氢作为荧光猝灭剂，猝灭CdTe/CdSe量子点的荧光，从而实现对CEA的检测.

2 比色型适配体传感器

比色法是依据检测体系中有色物质在紫外可见光谱中的吸收值来检测目标物的分析方法，可通过肉眼进行定性和半定量分析，也可通过紫外可见分光光度计进行定量分析.凭借其肉眼可见的检测结果、无需复杂设备且易于实现即时检测等优点，比色分析法受到了研究者们的广泛关注[22-24].目前，基于适配体的比色型传感器用于肿瘤标志物检测的研究，主要通过贵金属纳米颗粒的等离子体效应和催化底物进行显色反应实现检测信号的输出.

贵金属纳米颗粒的胶体溶液本身具有颜色且其显色受纳米材料的形貌和分散程度影响.在适配体传感器的构建过程中，可利用目标物直接或间接地影响纳米颗粒的形貌或分散情况，进而通过颜色改变实现定性和定量分析.例如，直径为13 nm的金纳米颗粒(Au NPs)在520 nm处有强吸收带(表面等离子带)，胶体溶液呈现酒红色，当目标物直接或间接引起Au NPs的聚集，光不再能够使纳米粒子均匀极化，从而引起红移及表面等离子带变宽，此时Au NPs的溶液呈现蓝色[25].JIANG等[26]利用适配体设计了一种比色型传感器用于外泌体蛋白质的分析.适配体能够吸附在Au NPs表面，作为保护剂防止颗粒在盐溶液中发生聚集.当目标物存在时，适配体发挥其识别元件的作用于目标物结合并离开Au NPs表面，失去保护的Au NPs发生聚集使得溶液颜色发生变化，从而实现对目标物的检测.此外，纳米材料的表面形貌发生改变也会引起溶液的颜色变化.ZHANG等[27]基于金银核壳纳米棒设计了一种磁控比色型适配体传感器用于外泌体的检测，修饰在磁珠上的适配体作为分子探针识别并捕获目标外泌体，进而在磁珠表面触发杂交链式反应(HCR)，形成大量碱性磷酸酶(ALP)标记的DNA长链，催化生成大量的抗坏血酸(AA)作为还原剂刻蚀金银核壳纳米棒表面的银壳，使得溶液颜色发生变化，从而实现对外泌体的可视化检测.

另一类比色型适配体传感器是基于生物酶或模拟酶催化显色反应进行的，其中酶促反应还能表现出信号放大效应，有助于传感器灵敏度的有效提升.辣根过氧化物酶(HRP)可催化过氧化氢参与的反应体系，得到具有特定颜色或者荧光的产物.例如，四甲基联苯胺(TMB)可被氧化生成蓝色氧化产物、邻苯二胺(OPD)可被氧化生成橘黄色产物，由于TMB、OPD等被氧化前后发生明显颜色变化，因而能够通过比色法甚至肉眼进行分辨.HUANG等[28]基于HRP催化TMB显色反应构建了比色型适配体传感器用于外泌体的检测.通过微孔板上修饰的抗体捕获目标物并形成夹心型信号响应模式，将适配体和引物DNA修饰的纳米金颗粒固定到微孔板上，在末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)的延长作用下生成生物素标记的DNA长链，进而捕获大量亲和素标记的HRP用于催化TMB显色反应，从而实现对目标物外泌体的高灵敏检测.近期研究发现，除了生物酶之外，许多纳米材料以及特定的DNA纳米结构(如hemin-G四连体)等也能表现出类过氧化物酶活性，为生物传感器的发展注入了新的活力.SHAHBAZI等[29]基于hemin-G四连体结构设计了一种比色型适配体传感器用于CEA的检测.适配体DNA链可与精心设计的辅助DNA链结合，阻止G四连体结构的形成，当目标物存在时，适配体与目标物结合，辅助DNA的首尾结构组合折叠，结合hemin后形成hemin-G四连体结构并表现出类过氧化物酶活性，催化2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)生成绿色氧化产物，引起溶液颜色变化，实现对目标物的测定.PENG等[30]进一步在反应体系中引入链置换反应(SDR)用于信号放大，目标物与适配体的结合触发SDR反应，在体系中形成大量的富含G碱基的自由DNA链，与hemin结合后形成hemin-G四连体结构，催化体系中TMB显色，根据体系吸光度变化实现目标物MUC1的定量检测.ZHANG等[31]将合成的Fe3O4@C核壳纳米线作为过氧化物模拟酶并在其表面修饰适配体序列，构建了夹心型比色传感器用于肿瘤标志物血小板源性生长因子(PDGF-BB)的检测.利用Fe3O4@C纳米线的模拟酶催化性能，可实现10 fmol·L-1到100 nmol·L-1范围内对PDGF-BB的良好响应；若在该体系中进一步引入hemin-G四连体结构，该方法检出限可由10 fmol·L-1降至50 amol·L-1.

3 电化学适配体传感器

电化学适配体传感器是采用适配体作为特异性识别元件的电化学传感技术，响应速度快，灵敏度高，操作简单，并具有良好的特异性[32-34].根据检测信号的不同，可以将用于肿瘤标志物检测的电化学适配体传感器分为电流型、阻抗型等.OU等[35]采用四面体DNA纳米结构-适配体组合作为识别元件探针和花样纳米酶/辣根过氧化物酶作为信号纳米探针，构建了一种夹心型电化学适配体传感器用于人类表皮生长因子受体2(HER2)的检测.该方法线性范围为0.1～100.0 μg·L-1，检出限为0.08 μg·L-1.ZHU等[36]基于滚环扩增(RCA)与铜纳米颗粒模板化生长构建了一种超灵敏、高选择性的电化学适配体传感器用于PSA的检测.该方法通过适配体与目标物PSA之间的特异性作用将适配体和引物DNA链共修饰的金纳米颗粒固定到PSA抗体标记的微孔板上，进而通过RCA反应生成大量聚胸腺嘧啶模板用于铜纳米颗粒的生长，随后通过溶出伏安法实现信号的输出.在优化的条件下，该方法能在0.05 pg·L-1到500 pg·L-1的浓度范围内实现对PSA的良好响应，检出限为(0.020 ± 0.001)pg·L-1.GAO等[37]设计了一种基于双适配体发夹DNA结构的电化学传感器用于microRNA-16(miR-16)和甲胎蛋白(AFP)的联合检测.该发夹结构同时包含miR-16的互补序列和AFP适配体序列，可以同时捕获miR-16和AFP.miR-16的存在使得发夹结构被解锁，其末端修饰的亚甲基蓝(MB)信号分子远离电极表面，从而引起MB电化学信号的降低.AFP的存在可将刀豆蛋白A(ConA)修饰的银纳米颗粒(Ag NPs)固定在电极表面，从而出现Ag NPs的电化学信号.因此，通过监测MB和Ag NPs电化学信号的变化情况可以轻松实现miRNA-16和AFP的同时检测.与传统的单一生物标志物检测方法相比，该检测策略可以通过监测两种血清学生物标志物提高肝细胞癌诊断的准确性.ZHOU等[38]提出了一种阻抗型电化学适配体传感器用于分化抗原44(CD44)的检测.通过金巯键固定在金电极表面的适配体与目标物作用之后发生构型改变，影响了[Fe(CN)6]3-/4-向电极表面的扩散过程，使得体系的阻抗值发生变化，从而实现对目标物的检测.该方法无需标记，操作简单，线性范围为0.1～1 000 μg·L-1，检出限为0.087 μg·L-1(S/N= 3).

4 光电化学适配体传感器

光电化学(PEC)传感是结合电化学测试平台和光化学反应发展起来的新兴检测技术，采用两种不同的能量分别作为激发源(光源)和检测信号(电信号)，能够有效降低背景信号，且由于具有灵敏度高、操作简单、易与微型化等优点，在肿瘤标志物的超灵敏检测方面有着巨大的应用前景.PEC适配体传感器采用适配体作为生物识别元件，在光电活性材料产生光电流的基础上，当外界电子给体/受体的性质、浓度等发生变化，或是由于材料本身内部的、表面的性质发生变化时，都会对光电信号产生影响；当光电活性材料作为生物功能化探针与目标分子结合引起表面性质的改变，或是目标分子使得环境中电子给体或受体浓度发生变化时，即可引起材料光电流的大小或性质变化，从而建立待测物与光电信号之间的定量关系.TIAN等[39]构建了一种竞争型PEC适配体传感器用于MUC1的检测，利用电化学阳极氧化技术在钛箔上合成TiO2纳米管(TiO2NTs)，在其表面电沉积金纳米粒子，以提高其导电性和生物相容性，并通过金巯键固定大量的MUC1适配体.CdTe量子点标记的辅助DNA链通过碱基互补作用结合在TiO2NTs表面，敏化TiO2形成较强的光电流信号.目标物与适配体发生竞争后结合后，CdTe量子点从TiO2NTs表面分离，从而引起光电流信号的变化.ZHANG等[40]基于Br、N共掺杂的TiO2/CdS复合结构构建了一种新型PEC适配体传感器用于CEA的超灵敏检测.Br、N共掺杂可使将TiO2的带隙宽度从3.2 eV降低到2.88 eV，且光吸收范围明显拓宽.目标物的存在使得原本锁闭的发夹结构被打开，结合外切酶III(Exo-III)辅助循环策略，形成大量巯基修饰的单链DNA，与光敏电极上的发夹结构DNA反应，并将CdS量子点捕获到TiO2表面，形成Br、N共掺杂的TiO2/CdS复合结构，显著提高TiO2的光电转换效率，实现光电流信号的显著提升.该方法在优化的条件下，可实现1 pg·L-1到1 μg·L-1浓度范围内CEA的良好响应，检出限为0.46 pg·L-1.为了进一步简化电极表面的修饰过程，研究者们提出了将生物识别过程与光敏电极分离的分体式光电化学传感策略：将生物识别过程从电极表面分离到微孔板等其他基质或者基于磁性纳米颗粒的准均相反应体系中进行.ZHANG等[41]以CoOOH覆盖的g-C3N4/CuInS2作为电极材料，建立了一种信号增强型PEC适配体生物传感器用于CEA的检测.CoOOH作为遮光材料，可有效抑制g-C3N4/CuInS2的光电信号.目标物存在时，磁珠表面的适配体与其结合，并触发杂交链式反应(HCR)在磁珠表面的进行，形成大量碱性磷酸酶(ALP)标记的DNA长链.生物反应体系中催化生成的抗坏血酸(AA)能够刻蚀电极表面的CoOOH 并暴露底层的g-C3N4/CuInS2，引起光电流信号的有效回升.在优化的实验条件下，该方法在0.02～40 μg·L-1的浓度范围内对CEA表现出良好的信号响应，检出限为5.2 ng·L-1.LI等[42]构建了一种独特的分体式光电化学适配体传感器用于CEA的检测.通过适配体连接的Fe3O4@SiO2@CdS-DNA1与SiO2-Au-DNA2在液相中形成三明治状结构，其中，SiO2-Au-DNA2的位阻效应很大程度上抑制了光电活性材料CdS在ITO电极表面的光电子转移；目标物存在时，可与适配体进行竞争性结合，导致三明治结构解离，光电信号得到恢复.该方法可实现1～6 000 ng·L-1浓度范围内CEA的良好响应，检出限为0.3 ng·L-1.

5 结论和展望

本文综述了近年来适配体传感器在肿瘤标志物检测中的研究进展(表1).适配体的出现及其筛选技术的不断发展为肿瘤标志物的特异性检测提供了新的途径.以适配体为生物识别元件，结合具有特殊光、电性能的纳米材料构建适配体传感器，可以有效提高检测方法的选择性和灵敏度.目前，适配体传感器在肿瘤标志物检测中的研究已经取得了一定的进展，但仍然面临着诸多挑战.首先，单一检测某种肿瘤标志物对于癌症早期诊断的特异性及敏感性往往不足，其定量结果尚难以成为癌症发生的准确判断依据.采用合理的手段实现多种肿瘤标志物的联合检测，以优势互补提高诊断准确性，是突破该瓶颈的理想手段.其次，适配体传感器如何有效克服非特异性吸附所带来的假阳性信号，仍然是实际样品中进行肿瘤标志物快速检测的重要挑战.随着适配体筛选技术以及纳米传感技术的不断发展，适配体传感器必将成为肿瘤标志物快速检测的有力工具，为癌症早期诊断和预后监测提供重要技术支持.

表1 不同适配体传感器对肿瘤标志物的分析性能对比