多肽介导肿瘤靶向纳米粒载体的制备及其特性
2021-01-12吴岩宫春爱王伟宏
吴岩,宫春爱,王伟宏
上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海201999
肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一,化疗在肿瘤的治疗中发挥重要作用,但部分患者化疗效果不理想,且化疗对患者的伤害较大,这是肿瘤治疗的难点[1-2]。造成这种现象的主要原因是药物对肿瘤组织缺乏选择性,杀伤肿瘤细胞的同时也损伤了正常细胞。肿瘤靶向治疗效果优于传统化疗,并且毒副反应低。因此,肿瘤靶向药物递送系统的研究备受关注[3-5]。为满足临床需要,2019 年 6 月—2020 年6 月我们制备了一种具有肿瘤微环境敏感的硫辛酸(LA)修饰的多肽载体,多肽序列为LA-K-L2-G2-R8(LA-KR),通过该载体将抗肿瘤药物准确递送至肿瘤细胞,从而增强药效,减少毒副反应。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞、试剂及仪器 乳腺癌细胞(MDA-MB-231,中国科学院上海分院),多肽单体合成(上海强耀生物科技有限公司),羧基荧光素标记的小干扰RNA(FAM-siRNA,上海畅硕生物科技有限公司),CCK-8 试剂盒(碧云天生物技术研究所),胎牛血清(FBS,美国Gibco 公司),半胱氨酸和硫辛酸(上海生工生物工程股份有限公司),甲醇等其他试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。核磁共振谱仪(400-Plus,美国 Varian 公司),粒度电位分析仪(ZS90,英国马尔文仪器有限公司),流式细胞仪(FACSCalibur,美国BD 公司),磁力搅拌器(B11-2型,上海司乐仪器有限公司),透射电镜(日本HITA⁃CHI公司)。
1.2 纳米粒载体的制备及多肽载体结构鉴定 将多肽单体溶于甲醇中,利用30%半胱氨酸盐酸盐作为交联剂,磁力搅拌12 h后吹干甲醇,得到半胱氨酸交联后的硫辛酸多肽载体(LA-KRss);取20 mg LAKRss 溶于1 mL 二氯甲烷中,加入去离子水8 mL,冰浴超声30 s,功率200 W。将溶液倒入盛有10 mL 去离子水的烧杯中,磁力搅拌挥发2 h 即得纳米粒载体。将LA-KRss 溶于重水,用600 MHz 磁共振氢谱仪鉴定LA-KRss结构。
1.3 纳米粒载体基本表征检测 利用透射电子显微镜观察纳米粒载体形态和均匀度,粒度电位分析仪检测纳米粒载体粒径及表面电位。
1.4 纳米粒载体临界胶束浓度筛选 按照1.2 制备空白纳米粒胶束溶液,配制1 mg/mL 胶束溶液。用芘作为荧光探针,在含有微量芘的容量瓶中配制各浓度的胶束溶液,用荧光光度计检测波长373 nm(I1)和383 nm(I3)的荧光度值,以空白载体浓度的对数为横坐标、I1/I3为纵坐标作图。
1.5 多肽载体LA-KRss 对FAM-siRNA 包裹能力检测 采用琼脂糖凝胶电泳实验。制备氮(N)/磷(P)值为0、0.5、1、2、3、4、5、10 的LA-KRss/FAM-siRNA,孵育 0.5 h,其中 FAM-siRNA 的加入量均为 1 μg。用TAE 缓冲液(由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成)制备1%琼脂糖凝胶。将制备好的LA-KRss/FAM-siRNA 加入琼脂糖凝胶中,设置电压为100 V,电泳时间30 min,在紫外光下显像并拍照。同时二硫苏糖醇(DTT)模拟的还原性条件下多肽载体LA-KRss 对FAM-siRNA 基因药物的压缩包裹情况。DTT可模拟肿瘤细胞内高谷胱甘肽的还原性条件。通过与N/P=0 时的条带对比,判断LA-KRss 对FAM-siRNA的包裹情况。
1.6 MDA-MB-231 对多肽载体LA-KRss 介导的基因药物FAM-siRNA 摄取情况检测 采用流式细胞术。将对数生长期的MDA-MB-231 接种于12 孔板,3×105/孔,培养 24 h,随机分为对照组、FAM 组、LA组,分别加入空白培养基、FAM-siRNA 1 μg+培养基、LA-KRss+FAM-siRNA 1 μg+培养基。每组设3个复孔。于培养箱继续培养6 h,用0.25%胰酶消化细胞,收集细胞,离心后重悬于PBS,并加入碘化丙啶染液。利用流式细胞仪检测,统计各组的荧光密度值。
1.7 纳米粒载体对MDA-MB-231 的毒性检测 采用CCK-8 法。将对数生长期MDA-MB-231 接种于96 孔板,1×104/孔,置于培养箱培养 12 h 后,将不同浓度(5、10、20、40、80、160 μg/mL)纳米粒载体溶液加入培养板中,每个浓度设6 个复孔。于培养箱中继续培养24 h。取出96 孔板,弃掉旧培养基,每孔加入90 μL培养基和10 μL CCK-8溶液,继续于培养箱中放置1 h,将96 孔板置于酶标仪振荡30 s,检测波长450 nm 处各孔的吸光度(OD)值,并计算细胞存活率。细胞存活率=(加药组OD 值-空白培养基组OD 值)/(空白细胞组OD 值-空白培养基组OD值)×100%。
1.8 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料用±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 多肽载体LA-KRss 的结构 多肽单体在半胱氨酸的作用下成功聚合。图谱中各峰归属:2.45、2.64及1.36~1.79属于硫辛酸部分的质子峰,0.80、0.86、2.15 分别属于亮氨酸中伯碳、仲碳、叔碳上的氢,2.24 属于羰基亚甲基上的氢,3.58 属于硫辛酸的甲基;4.17 属于赖氨酸中接近氨基的-CH2;3.12、3.27、3.71 属于接近精氨酸叔碳的-CH2-;4.24、3.88属于聚合物中的叔碳质子峰。
2.2 纳米粒载体的基本表征 透射电镜下观察到的纳米粒载体为圆形,均一性较好,粒径为(160.6±1.9)nm,电位为(16.3± 0.7)mV。
2.3 纳米粒载体的临界胶束浓度 I1/I3突变点处纳米粒浓度即纳米粒载体的临界胶束浓度为0.002 12 mg/mL。
2.4 多肽载体LA-KRss 对FAM-siRNA 的包裹能力 当 N/P 为 0~1 时,FAM-siRNA 不能被多肽载体有效压缩包裹,在电场作用下可见清晰条带;N/P=2时,未观察到明显条带,说明FAM-siRNA 在同等电场的作用下并未发生迁移,此时FAM-siRNA 被多肽载体有效包载;在DTT 条件下,N/P=2 时可以看到明显条带,多肽载体可在还原性条件下释放药物。
2.5 MDA-MB-231 对 FAM-siRNA 的摄取情况 对照组、FAM 组、LA 组光密度值分别为194.7 ± 35.4、363.7 ± 35.6、2 577.3 ± 224.1。LA 组、FAM 组光密度值高于对照组(P均<0.05),LA 组光密度值高于FAM组(P<0.05)。
2.6 纳米粒载体对MDA-MB-231 的毒性作用 纳米粒载体浓度为 5、10、20、40、80、160 μg/mL 时,细胞存活率分别为(98.3 ± 0.8)%、(97.3 ± 1.2)%、(97.6 ± 2.0)%、(96.1 ± 1.6)%、(95.5 ± 2.2)%、(95.2 ± 2.0)%,比较差异均无统计学意义(P均<0.05)。
3 讨论
长期以来传统的化疗药物在肿瘤的治疗中占有重要地位,但因其杀伤细胞的非选择性,导致了严重的毒副反应,限制其临床应用[6-8]。此外,多数化疗药物的水溶性差也是临床应用面临的一个重要问题[9],如常用化疗药物阿霉素、多西他赛、紫杉醇等,因其水溶性差常被制成不同剂型或通过合适的载药系统来提高溶解度。随着各种新型抗肿瘤药物不断研发,各种治疗手段的应用,综合治疗成为各种癌症患者更为合理的治疗策略。RNAi 可抑制相关癌基因的表达,有可能成为治疗肿瘤的新策略。研究表明,RNAi 技术与化疗等方法联合应用,可发挥协同作用,大幅提高抗肿瘤疗效[10-11]。但如何构建载体递送基因药物,是治疗的关键环节。
多肽是一种以肽键连接多个氨基酸的大分子。作为药物载体,多肽在体内可被生物降解,具有毒性低、无免疫原性、制备容易等特点。多肽类载体主要是指各种细胞穿膜肽。寡聚精氨酸八肽(R8)是目前最有潜力的细胞穿膜肽。研究发现,5~11 个连续的精氨酸串联具有显著的穿透细胞膜的能力,其中R8 最有效[12-13]。R8 具有与 siRNA 及 DNA 静电相互作用的潜力,并且动物模型研究显示其无毒性[14-15]。通过对它结构进行改造,使其可同时实现穿透细胞膜及包载基因药物。本研究通过固相合成法合成了硫辛酸修饰的多肽单体,由于硫辛酸五元环内二硫键在半胱氨酸的作用下能发生分子间交联,进而生成多个多肽单体聚合的载体。该多肽载体在MR 检查中显示多肽单体成功聚合。纳米粒载体结构中含有疏水性的空腔,能包载疏水性化疗药物,并且可以通过精氨酸的正电性压缩基因药物,同时可以响应肿瘤细胞内高谷胱甘肽的还原性条件,进而可以释放药物。本研究重点考察了所构建载体递送基因的应用研究,所构建载体LA-KR 富含带正电荷的氨基酸,能够携带负电荷的基因药物,如siRNA,通过该载体的包裹可以解决疏水性抗肿瘤药物水溶性差的问题。本研究主要考察所构建载体递送基因药物的效果,以希望为基因药物的递送提供参考。
细胞内部的谷胱甘肽含量很高,而肿瘤细胞内部的谷胱甘肽含量是正常细胞的4 倍[16]。基于肿瘤微环境的这个特点,可以构建肿瘤微环境还原性条件敏感的多肽纳米粒载体,载体进入肿瘤细胞后,其二硫键结构在谷胱甘肽的作用下会断裂降解,可以更好地释放其包载的药物,发挥药效[17-19]。硫辛酸的分子结构中含有二硫键,其侧链上的羧基活性较高,能与细胞膜的脂质双分子层融合,携带药物穿过细胞膜进入细胞内部。有研究表明,硫辛酸修饰的多肽载体可以实现肿瘤微环境敏感释药,毒性比较低,生物相容性好[20]。
载体把药物成功递送至肿瘤细胞发挥药效,不仅需要靶向性,还要求载体能够穿过肿瘤血管内皮间隙(多为380~780 nm),最终到达肿瘤细胞内。因此,载体的粒径大小至关重要。本研究制备的纳米粒载体粒径为160 nm 左右,可以通过肿瘤血管内皮间隙。为了考察该纳米粒载体进入肿瘤细胞的能力,通过流式细胞术检测细胞摄取情况。结果证实该纳米粒载体能够有效穿透细胞膜进入细胞内,确保将携带的药物载入靶细胞内,发挥抗肿瘤作用。此外,安全性也是药物载体必须要考察的因素之一。毒性实验结果表明,该纳米粒载体对MDA-MB-231毒性低。
综上所述,本研究合成的纳米粒载体克服了一般载体难以安全降解、携带药物进入细胞内部能力不足、自身毒性、释药能力不强等问题,并且增加了疏水性化疗药的溶解度。该纳米粒载体细胞毒性低,可以响应肿瘤高谷胱甘肽的微环境,并且能够穿透细胞膜将其包载药物带入细胞内部发挥药效。此外,该纳米粒载体能够成功压缩基因药物,为基因药物纳米递送载体及肿瘤靶向基因治疗提供参考。但本研究只是初步评价了纳米粒载体的基本特性,为进一步验证该载体的应用价值,后续将进行载体包载化疗药物的包封率、载药量和体外释放等研究。