β-catenin、NF-κB、c-myc 在尖锐湿疣皮损组织及角质形成细胞中的表达变化及意义

李真真，周真，罗卓迪，王智琴

广东省妇幼保健院，广州511400

尖锐湿疣是一种性传播疾病，由HPV 感染引起，其在年轻成人中的患病率为0.5%～1%，且复发率高。HPV 多在人体温暖潮湿的条件下繁殖，因此尖锐湿疣临床表现为男性包皮、龟头及女性阴部或肛门附近出现淡红色柔软的丘疹，数目逐渐增多，且体积逐渐增大，表面凸凹不平［1］。HPV 分为 100 多个亚型，临床可见的尖锐湿疣90%以上由HPV6 或HPV11 引起。角质形成细胞受损可引起多种皮肤疾病，过度增殖的角质形成细胞可发展为鳞癌或基底细胞癌［2］。β 连环素（β-catenin）是环连蛋白家族中的一员，参与多种细胞的增殖和分化［3］。核因子κB（NF-κB）参与多种基因的转录调控，在多种肿瘤中表达异常［4］。c-myc 是原癌基因，参与调控细胞的生长，在多种肿瘤中表达异常［5］。但有关NF-κB、c-myc 在尖锐湿疣皮损及角质形成细胞中的表达变化研究较少。本研究对尖锐湿疣皮损组织及角质形成细胞中NF-κB、β-catenin、c-myc 的表达变化进行观察，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2018 年 1 月—2020 年 5 月本院皮肤科收治的尖锐湿疣患者70例，均符合尖锐湿疣的诊断标准，其中初诊37 例、复发33 例。根据感染的HPV 分为HPV16/18 型32 例（高危型组）、感染HPV6/11型38例（低危型组）。高危型组男13例、女19 例，年龄 24～64（31.54 ± 4.93）岁，病程 1～15 年，皮损位于包皮（男）、宫颈（女）；低危型组男15例、女22 例，年龄22～65（32.50 ± 5.62）岁，病程1 个月～11年，皮损位于包皮（男）、宫颈（女）。另选志愿者30例作为正常对照组，为本院包皮环切或子宫肌瘤手术患者，均排除HPV 感染、无局部皮肤病或系统性疾病。其中男 10 例、女 20 例，年龄 26～64（33.70 ±6.15）岁。三组性别、年龄比较差异无统计学意义（P均>0.05）。各组均签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 组织中 NF-κB、β-catenin、c-myc 蛋白表达检测 采用免疫组化法。取尖锐湿疣患者皮损组织及正常对照组正常包皮、宫颈组织，石蜡包埋，制备切片。取石蜡切片，经脱蜡、水化，用pH7.4 的PBS 冲洗，修复抗原，用过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育，10 min 后加入一抗（鼠抗人NF-κB、β-catenin、c-myc单克隆抗体），室温孵育过夜，加入二抗，室温下孵育，10 min 后加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（50 μL）室温下孵育，10 min 后加 DAB 显色，复染，脱水、透明、封片，400 倍显微镜下观察染色情况，选取5个视野，计算100个细胞。对染色强度与阳性细胞百分比进行评分。染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1 分，黄色为2 分，棕褐色为3 分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞百分比<5%为0分，阳性细胞百分比5%～25%为1 分，阳性细胞百分比>25%～50%为2 分，阳性细胞百分比>50%～75%为3 分，阳性细胞百分比>75%为4分。以上两项评分相加，≤2分为阴性，>2分为阳性。

1.3 角质形成细胞的提取及鉴定 根据参考文献［6］采用无血清法提取角质形成细胞。取尖锐湿疣患者皮损组织及正常对照组正常包皮、宫颈组织，用PBS溶液（含庆大霉素50 μg／mL）浸泡，10 min后用PBS（含青链霉素100 U／mL）洗涤3 次，将以上组织剪成小块用PBS 洗涤2次，加入Dispase 酶，于4 ℃过夜，吸出酶液PBS 洗涤2 次，加混合消化液（0.25%胰酶和0.01%EDTA），于37 ℃下5 min，用胰酶抑制剂终止消化，吹打成单细胞悬液，离心5 min 弃上清液，重悬细胞，将细胞接种至培养板中，细胞长至70%～80% 进行传代。将培养好的细胞置于-196 ℃液氮中保存。经免疫组化染色，倒置显微镜下观察细胞呈铺路石状，鉴定为角质形成细胞。

1.4 角质形成细胞增殖能力检测 采用MTT 法。将原代角质形成细胞制成悬液，接种至96 孔板（200 μL／孔），每组设3 孔，孵育48 h。加入MTT 溶液（终浓度5 g／L），于培养箱中继续培养4 h，用DMSO（20 μL／孔）终止反应，振荡均匀，测定波长570 nm处的吸光度值。绘制细胞生长曲线。

1.5 角质形成细胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。提取角质形成细胞总RNA，用紫光分光光度计测定其纯度与浓度，筛选光密度值260/光密度值280为1.8～2.0的样品。按照RT-PCR 两步法试剂盒说明书将总RNA 反转录为cDNA。以逆转录成的cDNA 为模板进行PCR 反应。反应体系（25 μL）包括 2×Ultasybr mix⁃ture（12.5 μL）、RNase free dH2O（9.5 μL）、cDNA（1 μL）、上游引物（1 μL）、下游引物（1 μL）。β-catenin反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性 95 ℃ 45 s、退火60 ℃ 45 s、延伸 72 ℃ 45 s，40 个循环；72 ℃ 10 min。NF-κB 反应条件：预变性 94 ℃ 4 min；变性 94 ℃30 s、退火55 ℃ 60 s、延伸72 ℃ 2min，30个循环；72 ℃2 min。c-myc 反应条件：预变性 95 ℃ 30s；变性95 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸60 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 2 min。GAPDH：预变性 95 ℃ 30 s；变性 95 ℃5s、退火 60 ℃ 30 s、延伸 60 ℃ 30 s，40 个循环；72 ℃2 min。所用引物由上海生物工程有限公司合成。用 2-ΔΔct法计算 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 的相对表达量。β-catenin 上游引物序列5′-GCGTGGA⁃CAATGGCTACTCAAG-3′、下游引物序列 5′-TAT⁃TAACTACCACCTGGTCCTC-3′；NF-κB 上游引物序列 5′-CTAGTCGAGATGGCGCTGCAT-3′、下游引物序列 5′-CGCGGATCCACTACAACAGGCA-3′；c-myc上游引物序列5′-CCTGGTGCTCCATGAGGAGA-3′、下游引物序列5′-CTCCAGCAGAAGGTGATCCAGA-3′；GAPDH 上游引物序列 5′-GCACCGTCAAGGCT⁃GAGGAC-3′、下游引物序列 5′-TGGTGAAGACGC⁃CAGTGGA-3′。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。β-catenin、NF-κB、c-myc蛋白阳性表达率比较采用χ2检验；计量资料用±s表示，比较采用重复测量方差分析或方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组组织中 β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白表达 高危型组、低危型组组织中β-catenin 蛋白定位于细胞质与细胞核，正常对照组组织中β-catenin蛋白定位于细胞膜；各组组织中NF-κB 蛋白定位于细胞质；各组组织中c-myc 蛋白定位于细胞核。与正常对照组比较，高危型组、低危型组组织中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白阳性表达率高（P均<0.05）；与低危型组比较，高危型组组织中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白阳性表达率高（P均<0.05）。见表1。

表1 各组组织中β-catenin、NF-κB、c-myc蛋白表达情况［例（%）］

2.2 各组角质形成细胞增殖能力比较 培养24、48、72 h 各组角质形成细胞增殖能力比较差异无统计学意义（P均>0.05）；培养96 h，各组角质形成细胞增殖能力比较差异有统计学意义（P均<0.05），高危型组、低危型组细胞增殖能力高于正常对照组（P均<0.05），高危型组细胞增殖能力高于低危型组（P<0.05）。见表2。

表2 各组角质形成细胞的增殖能力（±s）

表2 各组角质形成细胞的增殖能力（±s）

组别高危型组低危型组正常对照组光密度值培养24 h 0.402±0.034 0.407±0.029 0.401±0.036培养48 h 0.414±0.028 0.411±0.023 0.408±0.019培养72 h 0.422±0.031 0.420±0.027 0.412±0.035培养96 h 0.467±0.034 0.435±0.038 0.421±0.029

2.3 各组角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表达比较 各组角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表达比较差异有统计学意义（P均<0.05）。高危型组、低危型组角质形成细胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相对表达量高于正常对照组（P均<0.05），高危型组角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相对表达量高于低危型组（P均<0.05）。见表3。

表3 各组角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表达情况（±s）

表3 各组角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表达情况（±s）

组别高危型组低危型组正常对照组n 32 38 30 β-catenin mRNA 1.895±0.043 1.507±0.037 0.604±0.030 NF-κB mRNA 1.205±0.146 0.792±0.153 0.445±0.106 c-myc mRNA 0.020 4±0.002 2 0.015 4±0.002 1 0.006 2±0.001 5

2.4 初诊与复发患者角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表达比较 复发患者角质形成细胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表达高于初诊患者（P均<0.05），见表4。

表4 初诊与复发患者角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表达情况（±s）

表4 初诊与复发患者角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表达情况（±s）

患者初诊复发n 37 33 β-catenin mRNA 1.605±0.037 1.882±0.029 NF-κB mRNA 0.816±0.117 1.182±0.132 c-myc mRNA 0.016 7±0.002 4 0.019 2±0.001 9

3 讨论

尖锐湿疣由HPV 感染导致肛周及生殖器部位发生的增生性病变，好发于性活跃人群（20～40 岁），是临床比较常见的性传播疾病。我国尖锐湿疣的发病率位居性传播疾病的第三位，仅次于非淋菌性尿道炎、淋病［7］。与尖锐湿疣相关的HPV 亚型主要为6、11、16、18 型，HPV6/11 为低危型，HPV16/18 为高危型。低危型病毒（HPV6/11）主要引起良性病变，但高危型病毒（HPV16/18）则与恶性肿瘤相关，约95%的宫颈肿瘤可检测到HPV DNA［8］。目前虽然尖锐湿疣的治疗方法较多，但其复发率一直居高不下，严重影响患者生理与心理健康。本研究对尖锐湿疣皮损组织及角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc 的表达进行检测，观察三者的表达变化，以期为尖锐湿疣的临床诊治及预防复发提供参考。

β-catenin 是新原癌基因的产物，可与20 多种蛋白质结合，参与多种细胞的增殖和分化。β-catenin是一种重要的细胞黏附分子和细胞骨架成分，也是Wnt信号通路中的关键组成部分。β-catenin 可在细胞内形成不同类型的复合体。因此其发挥的生物学功能也不同，其复合物可通过酪氨酸激酶和磷酸酯酶的活性调节平衡，影响细胞迁移及细胞间黏附；可调控细胞质游离的β-catenin 水平及其进入细胞核的量及上百种靶基因的转录［9-10］。有研究探讨β-catenin 蛋白表达与脑胶质瘤患者病理分级的关联，结果显示脑胶质瘤组织中β-catenin 蛋白呈高表达，与患者病理分级存在直接关联［11］。何旭等［12］研究证实，miR-21可能通过调控β-catenin表达，从而促进非小细胞肺癌患者病情进展，缩短其生存时间。研究结果显示在尖锐湿疣发病过程中，β-catenin mRNA表达异常，细胞周期发生改变［6］。

NF-κB 与多种相关基因转录调控有关，参与多种肿瘤的发生发展过程。NF-κB 可拮抗细胞凋亡；细胞周期蛋白 Dl 是 G1～S 期的正性调控因子，NF-κB可促进细胞周期蛋白Dl 的表达，从而促进细胞增殖。尖锐湿疣的发病还与感染者免疫功能异常相关，而TLR在免疫应答中起重要作用。TLR9可抗病毒感染。NF-κB 可作用于靶基因，促进各种炎症相关因子表达。TLR9 可激活 NF-κB 和子蛋白 1 释放多种炎症相关因子参与免疫应答［13］。多项研究结果显示，NF-κB 在多种肿瘤组织中高表达［14-17］。NF-κB通过促进细胞增殖和血管生成、免疫逃逸和抑制凋亡来参与尖锐湿疣的发生发展［18］。

原癌基因是一种正常细胞基因，可编码关键性调控蛋白，其在正常表皮中呈表达状态，可抑制细胞增生及诱导细胞分化。c-myc 是一种原癌基因，目前有关其在恶性肿瘤中激活的研究较多，在尖锐湿疣中的表达研究较少。研究发现，宫颈癌中c-myc蛋白呈高表达［19］。在子宫内膜样腺癌［20］、结肠癌［21］、鼻咽癌［22］、乳腺癌［23］组织中也呈高表达。研究发现，c-myc 主要表达于正常人表皮细胞基底层，而在尖锐湿疣皮损中，其分布于除角质层以外的表皮各层（基底层、棘层及颗粒层），阳性信号定位于细胞核［24］，这与HPV作用于角质形成细胞的分布一致。

本研究首先用免疫组化法检测β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白在尖锐湿疣皮损组织中的表达，结果显示，高危型组、低危型组组织中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白阳性表达率高于正常对照组，且高危型组组织中三种蛋白的阳性表达率最高。说明三者参与了尖锐湿疣的发生发展过程，且其表达变化与病毒分型有关。为进一步验证该结果，提取了角质形成细胞。HPV 最初感染的是角质形成细胞，细胞内病毒DNA 呈低水平合成状态，逐步建立稳定水平的病毒基因组，细胞恢复自身生长周期，然后使病毒周期进入生产阶段。角质形成细胞是炎症反应始动者，与其他免疫细胞相互作用产生炎症信号网络通路影响自身增殖分化及皮肤局部炎症反应［25］。本研究用MTT 法检测角质形成细胞增殖能力，结果显示高危型组细胞增殖能力>低危型组>正常对照组，可见感染HPV 的角质形成细胞存在异常增殖。用RT-PCR 法检测角质形成细胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表达，高危型组角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相对表达量最高，正常对照组角质形成细胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相对表达量最低。提示 β-catenin、NF-κB、c-myc 可能参与了角质形成细胞的增殖过程。另外，本研究对β-catenin、NF-κB、c-myc 与患者复发的关系也进行了探讨，复发患者角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表达高于初诊患者。说明，尖锐湿疣复发可能与β-catenin、NF-κB、c-myc有关。

综上所述，尖锐湿疣皮损组织及角质形成细胞中β-catenin、NF-κB、c-myc 呈高表达，三者表达变化与HPV 分型及复发有关。但本研究也存在不足，所选患者样本数较少，也未对β-catenin、NF-κB、c-myc在尖锐湿疣分型及复发中的作用机制深入探讨，后期研究将扩大样本进一步探讨其作用机制。