I期非小细胞肺癌SLC及其受体CCR7的表达与淋巴结微转移关系①

裴艳志，聂美楠，姜腾蛟，王晓强，李春磊，路 通，朱晓峰，邹志田(佳木斯大学附属第一医院心胸外科，黑龙江 佳木斯 154003)

肿瘤表面自分泌趋化因子受体7(CCR7)高表达与肿瘤自身分泌的配体次级淋巴组织趋化因子(SLC)或T细胞分泌的配体结合后可趋化肿瘤向淋巴结方向转移[1]。CCR7异常表达见于宫颈癌、大肠癌、前列腺癌、胰腺癌、食管鳞癌等多种肿瘤细胞，并且与肿瘤的淋巴结转移密切相关[2]。研究[3]显示SLC、CCR7在促进肿瘤淋巴结特异性转移方面可能发挥着重要作用，SLC、CCR7可能参与促进非小细胞肺癌淋巴结转移过程。本研究拟证明SLC及其受体CCR7与I期非小细胞肺癌淋巴结微转移及TNM分期具有相关性，并可能参与非小细胞肺癌淋巴管的生成及淋巴结转移的调控。为预测I期非小细胞肺癌淋巴结微转移提供临床指标，为非小细胞肺癌的靶向治疗提供靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院胸外科2010-01-01～2015-01-01共60例行肺癌根治的I期NSCLC患者标本，作为病例组。纳入标准：(1)经过影像学及病理学检查而确诊[4]；(2)均进行肺癌根治的I期NSCLC患者；(3)肿瘤直径<3cm；(4)包括肺癌组织、肺门(N1)淋巴结、隆突下(N2)淋巴结；腺癌，鳞癌。排除标准：(1)伴有呼吸道及肺部感染，以及胸腔积液的患者；(2)心血管疾病及其他病史的患者；(3)神志不清的患者。同时收集10例肺良性病变患者正常肺组织(对照组1)及20例肺良性病变患者淋巴结组织(对照组2)作为对照组。所有患者知情并愿意参加本研究，经本院伦理委员会同意并签订知情同意书。3组患者的一般资料无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组对象的一般资料比较

1.2 方法

1.2.1应用免疫组织化学SP法检测各组织中SLC及CCR7的表达

严格按照SLC及CCR7试剂盒(江苏雨桐生物科技有限公司提供)的说明书进行操作，具体步骤如下[5]：采集肺癌组织、肺良性病变患者的正常肺组织及淋巴结组织并进行常规的石蜡包埋，制作石蜡切片后并放于67℃烘箱中进行烘片2h，直到脱蜡至无水，并用pH7.4的PBS冲洗3次，然后进行切片的煮沸清洗。每张切片加入1滴的3%的双氧水，在室温的环境下进行孵育10min，并以阻断内源性过氧化物酶的活性，然后PBS冲洗3次，每次冲洗3min，并在显微镜下观察5min。最后进行苏木素复染，采用0.1%的盐酸分化，并用自来水进行冲洗，蓝化处理，得到切片经过梯度酒精的脱水并干燥，二甲苯洗脱到透明，使用中性树胶进行封固，晾干后观察。高倍镜下选取9 个视野计数细胞，每张切片选择5个高倍镜视野(400×)，应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。根据阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：<25%为1 分，25%～50% 为2 分，51%～75%为3 分，>75% 为4 分。取两项评分的乘积作为总积分，>5 分为阳性。

1.2.2RT-PCR检测SLCmRNA及CCR7mRNA表达

得到的肺癌组织、肺良性病变患者正常肺组织及肺良性病变患者淋巴结组织进行磨碎，首先在200μLPCR管中配制25μL反应体系，然后在94℃温度下预变性5min，再变性1min；52℃退火1min；72℃延伸1min，按照变性、退火、延伸步骤进行PCR扩增35次，最后72℃延伸10min。然后进行PCR相对基因表达分析，在所有PCR所检测的的基因中，以RPL32为内参基因，按照2-ΔΔCT 方法[6]，以正常大白兔来源的组织RNA为对照，来计算相对基因表达。首先制备电泳胶，然后按照操作说明将制备好的电泳胶放入电泳槽，同时将PCR产物倒入，加入缓冲液，样本混匀后放入电泳胶孔。PCR反应条件[7]：取5 μLPCR的产物，加点在纸上，然后使用6×上样缓冲液，反复吸打使其混匀，然后进行电泳，100V下电泳20～30min，并在紫外灯下进行观察，结果进行扫描保存。并计算SLC mRNA及CCR7mRNA的表达量。

1.2.3 相关性分析

收集患者的性别、年龄、淋巴结微转移、肿瘤大小和分化程度等资料，分析SLC及CCR7的表达与性别、年龄、淋巴结微转移、肿瘤大小和分化程度等的相关性。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 3组肺组织的SLC及CCR7表达

病例组与两组对照组的SLC、CCR7的表达阳性率，具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组肺组织的SLC及CCR7表达的阳性率[n(%)]

2.2 3组肺组织的SLC mRNA及CCR7mRNA表达

病例组的SLC mRNA及CCR7mRNA的表达量明显高于两组对照组，具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组肺组织的SLC mRNA及CCR7mRNA表达

2.3 SLC及CCR7表达与淋巴结微转移关系

SLC及其受体CCR7的表达与淋巴结微转移有关(P<0.05)；但是SLC及其受体CCR7的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小和分化程度无关(P>0.05)。见表4。

表4 SLC及CCR7表达与淋巴结微转移关系

3 讨论

肺癌的微转移是指肺癌在发生、发展的过程中一种表现，产生的肿瘤细胞会存活于淋巴结、血液循环、骨髓以及各种组织器官中，还没有形成显性的转移结节，也不会在转移部位出现任何临床表现，使用常规检查方法如影像学和临床病理学等均难以发现的一种微量转移[8]。虽然现阶段的肺癌分期系统能够较好地提示患者的预后情况，但对于I期的患者，其预后情况却不尽相同。这种结果是否患者在术前出现了隐匿性肿瘤微转移[9]。大量的研究证实，当肿瘤的直径<3cm可能会出现淋巴结微转移，进而导致预后结果较差的原因[10]，也可能是较早的发生远处转移及复发的重要因素[11]。

SLC是属于CC类的趋化因子，SLC是由活化的T淋巴细胞和内皮细胞产生，在高内皮小静脉和淋巴结T细胞区的高表达[12]。CCR7是SLC的高亲合力的受体，主要存在于幼稚T细胞、B细胞和树突状细胞表面[13]。研究[14]发现SLC在肿瘤常见转移部位呈现高水平表达，显示SLC与CCR7共同参与了肿瘤的转移与侵袭。SLC-CCR7生物学在细胞的转移方面有一定的作用，并且可以调控其它趋化因子的分泌[15]。但是关于I期非小细胞肺癌SLC及其受体CCR7的表达与淋巴结微转移关系未见报道，因此本研究具有一定创新性。

本研究的结果显示肺癌组织中的SLC及其受体CCR7的表达均比肺良性病变患者正常肺组织及肺良性病变患者淋巴结组织高，而且相关分析认为SLC及其受体CCR7表达与淋巴结微转移有关；与患者的性别、年龄、肿瘤大小和分化程度无关。这也说明了SLC及其受体CCR7表达在I期非小细胞肺癌中存在高表达，而且这种表达与I期非小细胞肺癌的淋巴结微转移。

理论上手术后进行辅助治疗对控制肿瘤细胞的亚临床转移和淋巴结微转移的患者具有一定意义，但是筛选高危人群进行合理治疗对患者的作用比较大。而I期非小细胞肺癌SLC及其受体CCR7的表达情况可以为此类患者进行判断，从而确定该进行治疗的患者，这对盲目的接受治疗更有意义，这也正是本次研究的意义的重要性。

综上所述，I期非小细胞肺癌SLC及其受体CCR7的表达为高表达，这种表达与淋巴结微转移有关。