硫代乙酰胺所致急性肝损伤大鼠肠道菌群的变化

王春妍 曹宇 郭远强 赵黎莉 冯雪 文君 李嘉

肝衰竭为临床常见的严重肝脏疾病，死亡率高。近年诸多研究发现，肠道微生态改变与肝衰竭发生发展密切相关。故此，本研究应用硫代乙酰胺造成急性肝损伤大鼠模型，应用高通量测序法分析急性肝损伤大鼠肠道菌群情况，了解大鼠肠道菌群结构、丰度与多样性的变化。

资料与方法

一、材料

(一)实验动物 选取SD雄性大鼠共16只，重230～250 g，清洁级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。许可证号SCKK(京)2014-0004。

(二)实验试剂 硫代乙酰胺，购自天津市福晨化学试剂厂。

二、方法

(一)模型的制备及获取 16只SD大鼠随机分为造模组及正常对照组，造模组10只，对照组6只。予以皮下注射硫代乙酰胺(TAA)600 mg/kg造模急性肝损伤模型，正常对照组大鼠给予同等剂量生理盐水皮注，48 h后造模完成。大鼠经麻醉后，留取回肠粪便进行肠道菌群16S rDNA测序分析。

(二)肠道菌群分析 处死大鼠后,留取回肠粪便,应用粪便DNA提取试剂盒提取粪便细菌基因组DNA，利用引物设计软件对各个细菌的引物进行设计。高通量测序文库的构建和基于 Illumina MiSeq 平台的测序由 GENEWIZ 公司(苏州, 中国)完成。应用 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA) 检测 DNA 样品的浓度，使用 MetaVxTM文库构建试剂盒 (GENEWIZ, Inc., South Plainfield, NJ, USA)构建测序文库。

以30～50 ng DNA 为模板，使用金唯智设计的一系列 PCR 引物扩增原核生物 16S rDNA 上包括 V3 及 V4 的 2 个高度可变区。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAA-TCC”序列的下游引物扩增 V3 和 V4 区。另外，通过 PCR 向 16S rDNA 的 PCR 产物末端加上带有 Index 的接头，以便进行 NGS 测序。 使用Agilent 2100 生物分析仪 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)检测文库质量，并且通过 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA)检测文库浓度。DNA 文库混合后，按 Illumina MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)仪器使用说明书进行 PE250/300 双端测序(具体平台以合同为准)，由 MiSeq 自带的 MiSeq Control Software (MCS)读取序列信息。

三、统计学分析

结 果

一、大鼠一般状态观察

造模组大鼠48 h造模完成，死亡1只，其余大鼠处死前均有不同程度的精神萎靡，反应迟钝，进食活动减少及中毒性鼓肠。对照组大鼠进食活动正常，精神状况好。

二、肝脏组织病理学结果

造模组大鼠肝组织呈灶状及片状坏死，大量炎症细胞浸润，肝窦结构破坏，急性肝损伤造模成功；对照组大鼠肝细胞排列整齐，肝窦结构清楚，未见明显炎症细胞浸润。

三、肠道细菌多样性分析

通过ACE指数和 Chaol指数评估两组样本菌群丰度；通过Shannon指数和Simpson指数评估两组样品菌群多样性。结果显示，造模组Chaol指数与对照组相比，有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；Shannon指数、Simpson指数及ACE指数分析，结果显示造模组上述指数与对照组相比有差异，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

四、微生物群落结构分析

(一)门分类等级细菌分布情况 在门水平上，两组大鼠粪便中均有9个平均相对丰度都不低于1%的优势菌门：厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、疣微菌门、脱铁杆菌门、软皮菌类、细菌菌类及蓝藻菌门。两组的优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门，造模组中依次占61.25%、32.48%，对照组分别占72.50%、25.80%，差异无统计学意义(P>0.05)；其次丰度较高的门包括变形菌门、疣微菌门，造模组分别占2.91% 和2.73% ，对照组中分别占0.59%和0.63%。肠道菌群构成差异分析，造模组变形菌门、疣微菌门菌群与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

(二)属分类等级细菌分布情况 在属水平上，造模组中丰度由高到低依次是：毛螺旋菌属13.59%、拟杆菌属10.74%、木虱科8.50%、阿克曼属 2.74%，对照组丰度由高到低依次是：毛螺旋菌属13.84%、乳杆菌属13.55%、木虱科10.74%、反刍球菌科4.55%。肠道菌群构成差异分析，造模组埃希菌属、阿克曼属、罗马尼亚梭菌属、真菌属及严格梭菌属丰度均高于对照组(P<0.05)，乳杆菌属丰度低于对照组(P<0.05)，见表3。

讨 论

目前研究已证实肠道菌群与多种肝脏疾病的发生发展及转归密切相关。肠-肝轴在肝脏疾病治疗中越来越受到重视[1]。

表1 肠道细菌多样性分析

表2 门分类等级肠道菌群构成差异分析

表3 属分类等级肠道菌群构成差异分析

本研究旨在应用高通量测序技术探讨硫代乙酰胺所致急性肝损伤大鼠肠道菌群的变化。本研究证实，硫代乙酰胺可造成大鼠急性肝损伤模型。既往研究表明，硫代乙酰胺造成急性肝损伤模型，在急性肝损伤时出现明显的肠道菌群失调[2]，但此研究所用的传统细菌培养鉴定方法存在一定局限性，故此本研究进一步应用高通量测序技术测定肠道菌群全基因组，并对急性肝损伤大鼠肠道菌群的各菌种相对丰度、多样性及菌群结构进行深度分析。

本研究选取了菌群富集的回肠，对大鼠肠道菌群16S V3-V4区进行高通量测序。结果显示造模组Shannon指数、Simpson 指数及ACE指数均显著高于对照组，提示急性肝损伤组大鼠小肠菌群的丰度及多样性均有升高，存在小肠细菌过度生长[3]。小肠细菌过度生长在肝脏疾病中广泛存在，并与其严重程度密切相关[4-5]。

本研究中，在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门两者之和占90%以上，属于优势菌群。厚壁菌门和拟杆菌门的比例被称为F/B比率，可用于评估是否存在肠道菌群失调[6-7]。本研究发现，造模组大鼠F/B比率低于对照组大鼠(P<0.05)，提示造模组大鼠存在肠道菌群紊乱。

变形菌门包含了诸多机会致病菌及病原菌，多为革兰阴性杆菌，产生脂多糖，造成肠源性内毒素血症，进而加重肝脏损伤。本研究提示：造模组变形菌门、变形菌门中具有代表性的埃希菌属，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示变形菌门在急性肝损伤的发生发展中发挥了一定作用。

在属水平上，肠道菌群构成差异分析，造模组埃希菌属、阿克曼属、罗马尼亚梭菌属、真菌属及严格梭菌属丰度均高于对照组(P<0.05)，乳杆菌属丰度低于对照组(P<0.05)，提示造模组大鼠肠道内出现埃希菌属增加及乳酸杆菌的消耗。埃希菌属丰度增高，对黏膜的侵袭性增强，诱导巨噬细胞产生并复制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，加重肝脏损伤。

研究表明，乳杆菌科可抑制肠道病原菌生长及定殖，改善肠道菌群结构，营养肠道黏膜，从而发挥显著的益生效果[8-11]。本研究发现，属水平肠道菌群构成差异分析提示乳杆菌属丰度明显下降，其合成乳酸和短链脂肪酸减少，从而抑制肠道上皮细胞再生，抗炎能力下降，加重肝脏损伤。提示在急性肝损伤治疗中，通过微生态制剂的补充有助于改善肠道菌群构成，减轻肝脏损伤。

本研究发现在急性肝损伤中乳杆菌科丰度下降，故此，拟进一步研究乳杆菌科在肝功能衰竭时对功能组学及代谢组学影响，深入探讨临床合理应用益生菌的依据。