鲎血蛋白壳寡糖-透明质酸微球的制备及其活性分析

王耀祺，蔡鹰，康信煌，邓春梅，吴育廉，张国光

（广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088）

作为 “无脊椎动物献血冠军”的鲎，其血液中蕴含了许多珍贵的活性物质［1］。但是，其生物利用度较低，因此，本研究以壳寡糖、HA为原料，制备负载鲎血蛋白的微球，以提高其生物利用度。同时研究包载不同分子量鲎血蛋白的微球对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶的抑制活性，为中国鲎药用和保健价值的进一步开发利用提供更为丰富的实验依据。

1 材料

1.1 仪器

二级膜分离实验机；核酸蛋白检测仪；酶标分析仪；冷冻干燥机 （上海田枫实业有限公司）；紫外可见分光光度计；扫描电镜；Zeta电位及粒度分析仪；低温高速离心机

1.2 药品与试剂

蛋白酶抑制剂Cocktail、胰蛋白酶、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、5，5-二硫代双-2-硝基苯甲酸、硫代乙酰胆碱、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、壳寡糖、透明质酸钠

2 方法与结果

2.1 鲎血蛋白的提取

根据文献［2-3］的方法，提取小于150、150～3000、大于3000的3段不同相对分子质量范围的蛋白水解物A、B和C。本文以水解物C作为被包载物进行表征。

2.2 鲎血蛋白-COS-HA微球的制备

精密称取5mg鲎血蛋白水解物，加入到含TPP的HA溶液中使其溶解。在搅拌条件下，将溶解好TPP、鲎血蛋白的HA溶液逐滴加入到壳寡糖水溶液中，搅拌30 min，即得鲎血蛋白-COS-HA微球混悬液，冷冻干燥后即得冻干粉。

2.3 正交实验设计

以微球包封率为指标，通过探究壳寡糖浓度、pH值、HA和TPP的浓度优化最适条件。每个因素采用三个水平，按照L9（34）正交设计表进行试验，因素表见表1，结果见表2。

表1 正交设计因素表

表2 正交设计结果分析表

由表2可知，微球制备的最佳条件为A1B2C2D2，即当壳寡糖质量浓度为2 mg／mL、HA质量浓度为0.1 mg／mL、TPP质量浓度为0.2 mg／mL及溶液pH为4.5时为最佳条件。

2.4 微球的表征

2.4.1 粒径与表面形貌

取微球混悬液置于扫描电镜中观察表面形貌及测量尺寸，结果见图1。

图1 COS-HA微球的SEM图

由图1可知，鲎血蛋白-COS-HA微球呈球形或类球形，大小较均一，粒径为 （3.11±0.42）μm。

2.4.2 Zeta电位的测定

取微球适量，用适量蒸馏水稀释，置于Zeta电位及粒度分析仪中测定。结果，Zeta电位测定值为（-34.35±2.66）mV，体系稳定。

2.4.3 包封率和载药量的测定

1）鲎血蛋白溶液标准曲线的制备。称取鲎血蛋白5mg，添加PBS缓冲液配制成0.1mg／mL的标准蛋白液。取6只试管依次加入标准蛋白液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，再补充PBS溶液至1 mL，各加入5 mL考马斯亮蓝。混匀后，在室温下静置2 min，以1号管作空白对照，在波长595 nm处，测定吸光度，绘制标准曲线。标准曲线回归方程为A＝6.615c+0.087，r＝0.9994。

2）包封率和载药量的计算。在4℃条件下，将微球混悬液离心 （4000 r／min）20 min，分离上清液与沉淀。取上清液，于595 nm处测定鲎血蛋白的含量。沉淀用纯化水洗涤，经冷冻干燥24 h后称重即得载药微球冻干粉。

计算公式：

包封率＝（W总-W游）／W总×100%；

载药量＝（W总-W游）／微球质量×100%。

式中，W总为鲎血蛋白总药量；W游为上清液中游离的鲎血蛋白药量。

结果，包封率为 （60.57±0.52）%，载药量为 （63.02±2.13）%。

2.4.4 体外释放实验

分别准确称取一定量载药微球、游离蛋白，混悬于3 mL pH6.8的磷酸盐缓冲液介质中，使浓度达到3 mg／mL，置于透析袋内 （截留量70 kDa）悬浮于含有30 mL释放介质的烧杯内，在37℃下恒温振荡 （100 r／min），分别在 1、2、3、5、7、9、12 h各准确取出1 mL释放介质，并添加等量介质。取出的释放介质于595 nm波长处测定吸光度。计算药物的累积释放率，并绘制体外释放曲线。结果见图2。

Q＝〔Cn×V0+（C1+C2+C3+……+Cn-1） ×V〕／m

图2 鲎血蛋白原液与载药微球的体外释放曲线

由图2可知，在第5h，鲎血蛋白原液累积释放率达到91.01%，而载药微球累积释放率仅为43.21%，12 h后，鲎血蛋白原液基本释放完全，而载药微球仅释放46.23%，说明具有缓释效果。

2.5 微球对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

按照文献方法［4］，取样品混悬液加入酶液，37℃孵化10min，再加入底物，37℃反应30 min，测定A405，计算酶抑制活性，以阿卡波糖作为阳性对照，蒸馏水作为空白对照。

抑制率 ＝ 〔1-（As-Ac） ／Ab〕 ×100%

结果可知，水解物微球A和B对α-葡萄糖苷酶抑制能力都随质量浓度增加而增长；当质量浓度达到0.2 mg／mL时，两者最大抑制率分别达到（14.57±0.50）%和（14.21±0.60）%，水解物C微球则对α-葡萄糖苷酶基本没有抑制活性，但都少于阿卡波糖的最大抑制率（28.42±0.20）%。

2.6 微球对乙酰胆碱酯酶的抑制活性

参照Ellman＇s比色法，取样品溶液加入乙酰胆碱酯酶液、5，5-二硫代双-2-硝基苯甲酸溶液和PBS溶液，于37℃孵化2 min，然后加入硫代乙酰胆碱溶液，37℃孵化30 min，测定A410，以石杉碱甲作为阳性对照，蒸馏水作为空白对照。按上式计算酶抑制活性。

结果可知，在0～0.04 mg／mL范围内，微球和石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶的能力均随浓度的增加而增加；达到0.04 mg／mL后，酶抑制能力不再显著增长。与石杉碱甲最高抑制率（99.22±0.60）%相比，微球水解物A和B的最高抑制率分别为（43.92±0.40）%和（30.58±0.50）%，微球水解物C的酶抑制活性最好为（67.45±0.20）%。

3 讨论

本研究从鲎血中成功提取并水解分离得到三种不同分子量的鲎血蛋白水解物并将其制备成鲎血蛋白壳寡糖-透明质酸微球，其生物相容性高，药物释放具有明显的缓释效果，三种蛋白水解物微球对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶具有一定抑制作用。