模拟高渗条件对茯茶中“金花菌”生长特性的影响

杨 苗， 张羽欣， 汪梦雯， 李康杰， 胡 歆， 夏 飞， 秦俊哲*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.国家林业和草原局 茯茶工程技术研究中心, 陕西 咸阳 712000)

0 引言

茯砖茶发源于泾阳，属于六大茶类中的黑茶[1]，其主要区别于其他黑茶的特征就是茶砖内部长有“金花”，“金花”是由散囊菌属产生的闭囊壳[2].茯砖茶能够消食解腻，深受大众喜爱.古时流传有“非泾阳之水不能制茯茶”之说.茯砖茶生产的关键在于其“发花”工艺，“金花菌”对于茯砖茶品质形成起着至关重要的作用[3-6].“金花菌”能够降低原料茶的苦涩味，增加其醇和感[7,8]，并且能够产生水溶性色素以及多种香气成分[9-12]，以形成茯砖茶独有的风味，并促进其品质的形成.目前研究表明，温度、湿度是控制“发花”的最主要因素；但是关于水质如何影响“金花菌”的生长，进而影响茯砖茶的品质，还尚未有结论.调研证实，泾阳地区地下水以微咸水为主，泾河流域地下水中阳离子浓度最高的为Na+、Ca2+、Mg2+，平均浓度高于黄河及长江等内陆河流域及全球河流[13,14]，且生产企业多以地下水加工茯砖茶.水中的这些离子对“金花菌”生长有何影响，其机制还尚不明确.

为探究“金花菌”对于高渗培养条件的生长适应，本研究从茯砖茶中分离“金花菌”，并采用形态学结合分子生物学技术进行鉴定.选择典型的2株“金花菌”对其在蔗糖和NaCl模拟高渗条件的下的生长特性进行研究.本研究对于揭示“金花菌”适应较高盐度的生长机制，为进一步明确茯砖茶品质形成的作用机理，提高茯砖茶品质奠定坚实基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料及菌种

茯砖茶，购自泾阳茯茶镇.

1.1.2 主要试剂和培养基

蔗糖、葡萄糖、氯化钠、氯化镁、氯化钙，以上试剂均为分析纯，购于天津市红岩化学试剂厂；琼脂粉、蛋白胨为生化试剂，产自北京奥博星生物技术有限责任公司；真菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司).

PDA培养基：马铃薯200 g煮沸过滤去渣， 葡萄糖2 g，琼脂20 g， 蒸馏水1 000 mL，自然pH.

CZG培养基：蔗糖20 g,氯化钠23 g,磷酸氢二钾l g,硝酸氨3 g,硫酸镁0.5 g,琼脂20 g.

1.1.3 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器(LS-C50L，江阴滨江医疗设备厂)；台式扫描电镜(Phenomenon Pro，复纳科学仪器有限公司)；凝胶成像仪(FR-1000，上海复日科技有限公司)；PCR仪(T100，Bio-Rad)；离心机(TDL-80-2B，上海安亭科学仪器厂)；霉菌培养箱(MJX-150-Ⅱ，北京科伟永兴仪器有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 “金花菌”的鉴定

(1)平板形态观察

将分离出的“金花菌”单点接种于不同培养基平板，在28 ℃下培养4 d，对其平板单菌落形态进行观察.

(2)电镜下“金花菌”形态观察

制样方法：样品台上粘贴导电胶，挑取“金花菌”至导电胶上，室温下放置24 h，使其干燥后进行观察.

(3)转录组间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列分析

无菌条件下刮取单菌落菌丝，加入灭菌后的石英砂进行研磨，使用天根试剂盒提取DNA.随后使用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行ITS序列扩增[15].反应体系包括上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq预混合Mix 12.5μL，DNA模板5μL以及5.5μL超纯水.扩增条件为：95 ℃预变性5 min，随后在94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s之后，进行32个循环的扩增.循环结束后，72 ℃延伸7 min[16]，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳确认片段大小后，交由生工生物工程股份有限公司进行测序分析.测序结果提交NCBI数据库进行比对，并采用MEGA 5.0软件绘制系统发育树，选用Neighbor-Joining绘图算法，重复迭代1 000次[17].

1.2.2 “金花菌”高渗条件下特性研究

(1)蔗糖含量对“金花菌”生长的影响

以CZG培养基为基础，分别添加20%、70%蔗糖，观察蔗糖产生的高渗条件对“金花菌”生长的影响.

(2)盐离子对“金花菌”生长的影响

以40%蔗糖蛋白胨培养基作为基础，添加0.5%～22.5%的NaCl，将分离出的“金花菌”接种于各盐浓度平板上，同时将从茯砖茶分离出的杂菌黑曲霉及青霉接于各盐浓度平板，观察其生长情况；以40%蔗糖蛋白胨培养基作为基础，对比添加CaCl2和MgCl2对“金花菌”生长的影响.

(3)高渗条件对“金花菌”的生殖方式的影响

挑取纯化后的“金花菌”菌株，将其单点接于不同培养基平板上，通过插片培养，2 d后开始在显微镜下观察其形态并拍照.

1.3 统计分析

每个试验重复3次，方差分析采用LSD法进行计算，结果以Means±SD表示.

2 结果与讨论

2.1 “金花菌”平板菌落形态

从茯砖茶中共分离出21株金花菌，选取2株平板形态差异较大的“金花菌”F-2和J-2单点接种于PDA培养基上，28 ℃培养4 d.如图1(a)所示，菌株F-2菌落中心呈深褐色，中心有褐色液滴产生，并且色素渗透至培养基中，菌株外圈菌丝呈白色；菌株J-2菌落呈鹅黄色，菌落外圈白色菌丝生长，该菌株不产生色素(如图1(b)所示).

(a)菌株F-2 (b)菌株J-2

2.2 “金花菌”的显微形态特征

“金花菌”既能够进行有性生殖也可进行无性生殖.在“金花菌”有性生殖过程产生子囊果(如图2(a)所示)，子囊果中包含着子囊(如图2(b)所示)，子囊中内含8个子囊孢子(如图2(c)所示).子囊果外层有着一层外壳包被，在释放孢子时，外壳破裂，释放出其中的子囊，子囊在子囊果中有相应的“座位”，排列紧凑，且不形成挤压，子囊在发育初始阶段外面包被有一层薄膜，待发育成熟后，逐渐撑破外层薄膜，孢子被释放出来，孢子的外层呈坚硬状.

(a)包被完整的子囊果 (b)破裂的子囊果

“金花菌”无性生殖产生分生孢子，分生孢子头上分生孢子呈串状排列，分生孢子为中空椭圆形，粗糙具小刺.分生孢子直接裸露在外，外层无包被(如图3所示).

菌株F-2与J-2的子囊孢子均呈现凸镜状，凸面具有小疣或褶皱，并且具有赤道(如图4(b)、(d)所示).但F-2与J-2的子囊孢子形态不完全相同，F-2的子囊孢子脊较短，不规则，且赤道部分较宽，根据《中国真菌志》及曲霉分类学[18]，认为F-2与Aspergillusintermedius孢子形态极为相似，F-2可能为A.intermedius.J-2的赤道沟较深，且凸面上形成网结的肋状凸起，这与肋状散囊菌(A.costiforme)的形态特征相似，且其在PDA、40%蔗糖蛋白胨、40%蔗糖麦芽汁、20%蔗糖CZG及70%蔗糖CZG等多种培养基上培养均未见到有色素产生，结合其培养特征[19]，认为J-2与肋状散囊菌(A.costiforme)具有高度一致性.

(a)分生孢子头 (b)串状排列

(a)F-2子囊果(1 450×) (b)F-2子囊孢子(7 700×)

2.3 ITS序列分析

“金花菌”F-2和J-2与Aspergillus的多个菌株具非常高的相似度.通过构建系统发育树(如图5所示)，发现F-2、J-2与Penicillium(青霉属)，Talaromyces(篮状菌属)等分别属于两个簇，与Eurotiummedium,A.intermedius,A.costiformis等9个菌株属于同一分支中，具有非常高的同源性.

图5 F-2及J-2的系统发育分析

“金花菌”是以冠突散囊菌为主的散囊菌属真菌，散囊菌属真菌具有高度同源性[20,21]，根据其系统发育分析，菌株F-2和J-2与A.intermedius等9株菌高度同源性.由于ITS的分辨率达不到种水平以下的分类[21]，经过ITS序列比对只能将两株“金花菌”鉴定到属.系统发育树中E.medium与A.intermedius属于同一分支，这是由于以前对于该属的命名分为有性型和无性型命名，国际青霉菌和曲霉菌委员会(ICPA)为了避免命名混淆，将所有的Eurotium分类群转移到Aspergillus[18]，这种做法也被广为接受，很多作者倾向于使用Aspergillus[22].

结合菌株F-2和J-2的形态特征，F-2极可能为A.intermedius，J-2与肋状散囊菌(A.costiforme)的形态特征吻合，具有极高相似度.

2.4 蔗糖模拟高渗条件对“金花菌”生长的影响

两株“金花菌”在20%蔗糖CZG培养基上，气生菌丝生长受限，产生较多子囊果，菌丝包裹子囊果在培养基表面形成米褐色小斑状.随着培养时间延长，菌落中间的斑点逐渐变大，颜色加深，未见有液体渗出.在此培养基上只进行有性生殖，未见有分生孢子出现.F-2在培养初期菌落颜色呈现浅黄色，当培养至6 d时，产生近橄榄褐色色素，渗透到基质中(如图6(a)、(b)所示)；J-2始终未产生色素，反面为黄色.

采用70%蔗糖CZG培养基模拟高渗条件，研究“金花菌”的生长适应特性.两株“金花菌”在70%蔗糖CZG培养基上较20%蔗糖CZG培养基上约晚24 h萌发.生长初期，无色气生菌丝生长，产生灰绿色分生孢子头，随后，产生黄色闭囊壳，菌落呈现黄色，菌落边缘仍有灰绿色分生孢子头.在70%蔗糖CZG平板上存在有性生殖和无性生殖两种生殖方式.菌株F-2在20%蔗糖CZG平板上产生色素，在70%蔗糖CZG平板上不产生色素；菌株J-2在70%蔗糖CZG也较20%蔗糖CZG平板上颜色更浅(如图6(c)、(d)所示 ).

(a)20%蔗糖CZG菌落形态 (b)70%蔗糖CZG菌落形态

“金花菌”在添加高浓度蔗糖的CZG平板上依然能够生长，而且长势旺盛，表明其能够耐受高糖的环境.有研究者从蔗糖厂的环境及生产的蔗糖成品中均分离出谢瓦散囊菌(A.chevalieri)，该种真菌能够耐受高糖条件，成为蔗糖生产过程中的一种主要污染菌[23]，因此“金花菌”在添加70%蔗糖的培养基中仍然能够生长很好.“金花菌”在大多数情况下进行有性生殖，但在高糖诱导下产生无性型，主要是由于有性生殖是对营养限制及环境刺激作出的反应，而在营养丰富的时候会进行无性生殖[24].

2.5 盐离子对“金花菌”生长的影响

“金花菌”在40%蔗糖蛋白胨培养基上培养4天菌落直径约为3.8 cm.在添加了0.5%～22.5%的NaCl的40%蔗糖蛋白胨培养基上，“金花菌”均能够生长.“金花菌”在NaCl浓度较低的情况下形成较多黄色闭囊壳，菌落中心呈黄色，外部边缘为白色绒毛状菌丝，但是随着NaCl浓度的增大，在萌发后先产生大量茂盛的白色菌丝体，其菌落呈灰绿色，随着菌的不断生长，开始逐渐形成黄色闭囊壳.在添加0.5%～15.5%的NaCl培养基中培养4天，菌落直径如表1所示.

两株“金花菌”均在添加4.5% NaCl的培养基上菌落直径最大，生长最好，J-2的菌落直径为4.53 cm，而F-2的菌落直径达到4.82 cm.随着培养基中NaCl含量的升高，“金花菌”生长受到抑制，其菌落直径也随之减小.虽然高浓度NaCl抑制“金花菌”萌发，但2株“金花菌”在高糖高盐培养基上仍能很好生长(如图7所示).与“金花菌”对比，黑曲霉在添加0.5%～15.5% NaCl的平板上可以生长，但当NaCl添加量达到11.5%时，其生长受到抑制，萌发时间延长.青霉在含NaCl平板中生长受限，当NaCl含量达到8.5%时，菌株未萌发.

(a)16.5% NaCl F-2形态 (b)16.5% NaCl J-2形态

“金花菌”能够耐受一定浓度的CaCl2和MgCl2，Mg2+一定程度上可促进“金花菌”生长，并且其他研究证实，镁离子能够促进真菌菌体生长[25].通过对泾阳地表水和地下水中化学成分的分析，Na+和Mg2+为主控阳离子.适量NaCl会促进“金花菌”生长，随着NaCl含量的增加，会推迟“金花菌”萌发时间.

表1 不同NaCl浓度40%蔗糖蛋白胨培养基上F-2和J-2菌落直径

将茯砖茶中分离出的黑曲霉、青霉同“金花菌”同时接于不同浓度NaCl含量的平板上，发现当NaCl含量达到8.5%时，青霉不能生长，而当NaCl浓度达到15.5%时，黑曲霉生长已经受到极大抑制，当NaCl含量增至22.5%时，“金花菌”仍然能够生长.一方面高浓度的NaCl能够抑制其他杂菌生长，另一方面“金花菌”能够耐受高浓度NaCl，因此水中高浓度NaCl有利于茯砖茶“发花”而不受到杂菌污染.

2.6 高渗条件对“金花菌”的生殖方式的影响

“金花菌”在高渗培养基上，气生菌丝生长茂盛，随后形成球型顶囊(如图8(a)所示)，在顶囊上长出单层小梗(如图8(b)所示)，逐渐发育，在分生孢子梗上产生分生孢子(如图8(c)、(d)所示).“金花菌”在70%蔗糖CZG培养基上及在高盐浓度的40%蔗糖蛋白胨培养基培养的过程中，开始先进行无性生殖，随着培养时间的延长，逐渐进行有性生殖.

(a)球型顶囊 (b)顶囊长出单层小梗

“金花菌”在处于胁迫环境时可以通过选择生殖方式以适应环境.“金花菌”常规培养条件下均进行有性生殖.在高盐高糖诱导下，“金花菌”改变生殖方式，进行无性生殖，产生分生孢子，无性生殖是一种较低级的生殖方式.通过观察发现随着NaCl含量的升高，“金花菌”产生灰绿色分生孢子头进行无性生殖.有研究发现在平板中添加3 M的NaCl会使“金花菌”只进行无性生殖[24]，在本研究中，当NaCl添加量为18.5%时，仍然存在有性和无性两种生殖方式，可能是由于选用的培养基不同，营养状态不一致导致.在极端环境时，首先菌丝生长进行营养增殖，选择较为简单的无性繁殖方式产生分生孢子，随后再进行有性生殖，产生子囊孢子.“金花菌”主要进行有性生殖，使其能够耐受逆境.在胁迫环境下，“金花菌”子囊果、子囊对子囊孢子形成重重保护，使其能够耐受较高的渗透压，在条件适宜时又会重新萌发.“金花菌”的子囊孢子结构较分生孢子更稳定，分生孢子在外力作用下发生变形，甚至破裂，而子囊孢子几乎无变化.“金花菌”不仅存在结构优势能够适应逆境，同时存在一些抗逆基因，能够有利于其对抗胁迫，在一些研究中发现谢瓦散囊菌(A.chevalier)中分离出GDH基因能够有利于水稻耐干旱胁迫[26].

“金花菌”在茯砖茶的生产过程中是优势菌，具有极强降解能力，但在其他行业中，如制糖工业，烟业中，“金花菌”却是一种污染菌，通过本研究对“金花菌”对各种离子的耐受以及耐高渗特性的揭示，更有利于“金花菌”在茯砖茶生产中的应用及在其他行业中的控制，为工业中有效利用和控制“金花菌”奠定基础.

3 结论

茯砖茶中分离出两株“金花菌”F-2和J-2分别与Aspergillusintermedius和肋状散囊菌(Aspergilluscostiforme)具有高度相似性.2株“金花菌”能够在22.5%的NaCl和10.5%的CaCl2和MgCl2培养基上能够生长，且MgCl2的添加对“金花菌”的生长具有明显促进作用.“金花菌”能够耐受70%蔗糖浓度，在高糖、高盐模拟的高渗条件下，“金花菌”气生菌丝生长旺盛，产生灰绿色分生孢子头，进行无性生殖.“金花菌”极可能通过选择生殖方式对抗高渗胁迫，其有性生殖产生的子囊果结构更能抵抗不利环境.