高效液相色谱法测定枸杞中的黄曲霉毒素
2021-01-11李单单贺金涛
李单单，贺金涛
（河南进口肉类指定口岸漯河查验区服务中心，河南漯河 462000）
黄曲霉毒素（AFT） 是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉（Aspergillus flavus） 寄生曲霉（A.Parasiticus） 产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的几率最高。其具有高毒性和致癌性，1993 年被世界卫生组织癌症研究机构划定为I 类致癌物[1-3]。黄曲霉毒素常以AFTB1，AFTB2，AFTG1，AFTG24 种形式存在，其中AFTB1的毒性最强[4]。黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免，2017 年最新颁布的国家食品安全标准《食品中真菌毒素限量》规定了玉米、玉米面（渣、片）、玉米制品、花生及其制品、花生油、玉米油中AFTB1的最高限量为20 μg/kg，稻谷、糙米、大米、植物油脂（花生油、玉米油除外） 中AFTB1的最高限量为10 μg/kg，小麦、大麦、其他谷物、小麦粉、麦片、其他去壳谷物、发酵豆制品、其他熟制坚果及籽类、酱油、醋、酿造酱中AFTB1的最高限量为5.0 μg/kg。人们经常使用高效液相色谱法检测试样中的黄曲霉毒素，能同时对样品中的黄曲霉毒素种类进行定性、定量分析，具有快速、高效、灵敏、定量准确等优点，在黄曲霉毒素检测方面发挥着重要的作用，已经成为检测黄曲霉毒素的主要方法[5-7]。
枸杞兼具多种医疗保健功效，是卫生部批准的药食两用食物，能够增强非特异性免疫功能、提高抗病能力，还具有抗衰老、抗疲劳、抗辐射损伤、调节血脂、降血糖、降血压、养肝、滋肾、润肺等多种保健功效。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
安捷伦1200 型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司产品；配荧光检测器G1321A，Cloversil Myco-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；Aura光化学衍生器PHRED，美国Aura 产品；黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，北京勤邦生物技术有限公司产品；科乐福12 位泵流操作架；ML204T 型电子分析天平，梅特勒- 托利多仪器上海有限公司产品；多位涡旋振荡器、超声波清洗器，中国昆山舒美产品；0.22 μm有机滤膜，天津津腾公司产品。
黄曲霉毒素混合标准物质[Pribolab]；甲醇（色谱纯），美国Fisher 提供；试验用水为Milli-Q Advantage A10 超纯水，美国Millipore 公司提供；氯化钠（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司提供；玻璃纤维滤膜90 mm。
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线的绘制
将黄曲霉毒素混标用体积分数45%的甲醇溶液稀释成7 个不同质量浓度的标准系列工作液，以此建立标准曲线。其中，AFTB1的系列质量浓度分别为1，4，8， 10，20，40，50 ng/mL；AFTB2的系列质量浓度为0.26，1.04， 2.08，2.60，5.20，10.40，13.00 ng/mL；AFTG1的系列质量浓度为1.2，4.8，9.6，12.0，24.0， 48.0，60.0 ng/mL；AFTG2的系列质量浓度为0.25， 1.00，2.00，2.50，5.00，10.00，12.50 ng/mL。用液相色谱仪对该系列标准溶液进行上机检测，建立标准工作曲线。
1.2.2 液相色谱条件
液相色谱柱：Cloversil Myco-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；色谱柱柱温40 ℃；流动相：甲醇∶水= 45∶55，流速0.8 mL/min，进样量80 μL；荧光检测器：激发波长360 nm，发射波长440 nm。
1.2.3 样品前处理
准确称样（4.000 g） →加入氯化钠（1.0 g） →准确加入20 mL 甲醇- 水（70∶30） →振荡混匀（20 min）→超声提取（20 min） →离心（8 000 r/min，5 min） →取上清液（10 mL） →加入超纯水（30 mL） →涡旋混匀→过玻璃纤维滤纸→准确取20 mL 液体→过免疫亲和柱→亲和柱中加入10 mL×2 超纯水（最后把水抽干） →甲醇洗脱（1.0 mL） →水冲洗（1.0 mL），甲醇和水收集到一起→过有机滤膜→高效液相色谱分析。
2 结果与分析
2.1 线性关系
在1.2.2 条件下对1.2.1 系列标准品进行测定，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。
黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的线性回归方程、相关系数、线性范围见表1，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2线性范围见图1。
图1 黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2 线性范围
2.2 精密度试验
在1.2.1 中选择质量浓度为10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL 的黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2混合标准溶液，连续进样6 次，记录峰面积。黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2峰面积的RSD 分别为0.79%，1.38%，0.49%，0.54%，表明仪器精确度较好。
黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2（10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL） 的精密度（n=6） 见表2。
2.3 回收率试验
取阴性样品，AFTB1的3 个添加水平分别为2.5，10.0，30.0 μg/kg；AFTB2的3 个添加水平分别为0.65，2.60，7.80 μg/kg；AFTG1的3 个添加水平分别为3，12，36 μg/kg；AFTG2的3 个添加水平分别为0.625，2.500，7.500 μg/kg，加入对应体积的标准品静置过夜，按照1.2.3 样品前处理方法处理样品，上机测定。
表2 黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2（10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL） 的精密度（n=6）
样品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2回收率（n=3）见表3，高效液相色谱图见图2。
图2 高效液相色谱图
2.4 检出限和定量限
根据信噪比S/N=3 和S/N=10 确定目标物的检出限和定量限，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的检出限分别为0.03，0.01，0.03，0.01 μg/kg；黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的定量限分别为0.10，0.03，0.10，0.03 μg/kg。
3 结论
黄曲霉毒素是对人类健康危害较大的真菌毒素，黄曲霉毒素污染问题长期受到社会关注[8]。黄曲霉毒素可能在食品原料中也可能在食品加工、运输、储存等任一环节中产生。因此，对黄曲霉毒素的检测能够有效保障人们的餐桌安全。
利用免疫亲和柱- 高效液相色谱柱后光化学衍生法检测枸杞中的黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，4 种毒素的出峰时间早，节省检测时间，分离度满足试验需求，用柱后衍生的方法操作简便、实用性强。枸杞既是食材又是中药，是一种营养成分比较高的植物资源，因此加强对枸杞中黄曲霉毒素的检测，可为人们放心食用提供数据支持。
