大鼠肥大心肌细胞动作电位、瞬时外向钾离子电流变化及其分子机制

范茁，吴振强

华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006

心血管疾病是威胁中老年人身体健康的主要疾病，发病率随年龄增长而提高。心肌肥大是高血压、心肌缺血等心血管疾病发展过程中的病理状态，持续的心血管压力、容积过载会诱发心肌细胞多种信号分子的改变，引起心肌纤维化，舒缩功能损伤，最终导致心衰死亡。心肌肥大的一个重要临床表现是心率失常，触发了一系列细胞因子及生化分子的改变［1-4］，严重心率失常会诱发猝死，心率失常在单细胞电生理水平上则表现为动作电位时程和跨膜离子电流的改变。瞬时外向钾离子电流（Ito）存在于多种哺乳动物心肌组织，其构成成分有Kv4.2、Kv4.3、Kv1.4等，KChIP作为辅助亚基可以调节Kv通道的表达、激活和失活等动力学特性。大鼠等啮齿类动物心肌细胞Ito主要由Kv4.2和Kv4.3组成，受KChIP2亚基调节。Ito可影响心肌细胞动作电位的早期复极化的形态，决定动作电位的时程［5-11］。2020年3—11月，我们观察了大鼠肥大心肌细胞动作电位、Ito变化，并探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及溶液 配制溶液盐类、ISO购自美国Sigma公司；Ⅱ型胶原酶和蛋白酶购自美国Wrothington公司；肝素钠和戊巴比妥钠购自阿拉丁试剂公司；RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司。

1.2 大鼠肥大心肌细胞模型制备 ①心肌细胞分离：采用酶解法急性分离大鼠心室肌细胞，具体方法如下：取1只成年雄性SD大鼠，腹腔注射肝素钠（1 000 U/kg），戊巴比妥钠（0.2 mg/100 g）注射麻醉，腹部向上平放于托盘上，用剪刀减去胸部被毛，之后用75%的酒精消毒胸部皮肤，用灭菌剪刀剪开胸部皮肤组织，露出剑突，用止血钳夹紧并掀开剑突，用消毒小剪刀剪开胸部隔膜，露出心脏，迅速剪断心脏主动脉、肺动脉及周围组织，将心脏放于预冷无钙台式液（Tyrodes）中，轻轻挤压排出血液，之后将心脏悬挂于灌流装置上，灌流无钙台式液3 min，用0.8 mg/mLⅡ型胶原酶和50μmol/L Ca2+的台式液继续灌流消化2 min，接着用含0.8 mg/mLⅡ型胶原酶、0.1 mg/mL蛋白酶和200μmol/L Ca2+的台式液循环灌流消化30 min，至心脏软榻时剪下心室，在含有0.8 mg/mLⅡ型胶原酶和600μmol/L Ca2+的台式液中剪碎并振荡消化3 min。过滤后于500 r/min离心1 min，最后将所得细胞在M199培养基中重悬并分置于培养皿待用。②肥大心肌细胞模型制备及鉴定：通过异丙肾上腺素孵育法在体外诱导心肌细胞肥大，具体方法如下：将上述酶解急性分离方法得到的心肌细胞分置于10个左右35 mm的小培养皿，培养皿数量由急性分离得到的细胞浓度决定，每次试验略有差异。将细胞分为两组，其中一组加入5μmol/L的异丙肾上腺素（观察组），另一组则加入同等体积的去离子水作为对照（对照组），在含5%CO2的细胞培养箱中孵育培养24 h后可用于做电生理实验或分子生物学实验。肥大心肌细胞模型通过细胞形态观察和检测细胞肥大标志因子ANP和BNPmRNA表达两种方法进行鉴定。我们使用奥林巴斯显微镜获得细胞图片，之后用图像分析处理软件Image Pro Plu 6.0对观察组和对照组的细胞面积进行计算。随机选取视野内100个细胞进行统计分析，分析显示观察组细胞面积为（2 084.5±186.9）μm2，对照组为（1 694.7±103.5）μm2，观察组细胞面积较对照组有显著增大（P<0.05）。通过实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测测定细胞肥大标志因子ANP、BNP mRNA。首先用Takara RNAiso plus试剂盒提取心肌细胞总RNA，之后利用逆转录试剂盒去除基因组DNA，设置好反应程序，将样品放入RT-PCR仪进行逆转录反应。GAPDH为内参基因，用于对表达量进行校正，校正后mRNA表达量与对照组做比值得到相对表达量。观察组ANP、BNPmRNA相对表达量分别增加至对照组的（1.6±0.1）倍和（2.8±0.08）倍。上述结果表明，成功诱导了体外肥大心肌细胞模型。

1.3 大鼠肥大心肌细胞动作电位及Ito检测 动作电位检测：采用膜片钳的电流钳记录模式，由时长5 ms，幅度900 pA的刺激脉冲电流诱发，动作电位时程取复极化90%的时间（APD90）。膜片钳系统使用HEKA EPC10放大器，Patch-Master记录软件。所有数据使用Origin8.0进行统计分析。Ito检测：采用膜片钳的电压钳记录模式，钳制电压为－80 mV。刺激电压为-40～+50 mV、梯度为10 mV的脉冲电压，持续时间300 ms。细胞内外液成分如下：外液（单位mmol/L）：NaCl 138，KCl 4，MgCl21，CaCl22，NaH2PO40.33，HEPES10，Glucose 10，CdCl20.3（pH 7.4）。内液（单位mmol/L）KCl 130，MgCl21，Mg-ATP 5，EGTA 10，HEPES5（pH 7.2）。

1.4 大鼠肥大心肌细胞Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR方法检测肥大心肌细 胞Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA，具体 方法 同“1.2”检测步骤。

1.5 统计学方法 采用Origin8.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组心肌细胞动作电位时程比较 观察组和对照组动作电位时程（APD90值）分别为（68.2±4.1）、（52.0±5.9）ms，两组比较，P<0.05。

2.2 两组心肌细胞Ito幅度、电流密度比较 观察组和对照组在+50 mV刺激电压下的电流幅度分别为543、1 116.1 pA，在+50 mV刺激电压下的电流密度分别为（2.4±0.5）、（5.0±1.0）pA/pF，两组比较，P均<0.05。

2.3 两组心肌细胞Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA相对表达量比较 观察组和对照组Kv4.2 mRNA相对表达量分别为56.2±6.9、100±24.8，Kv4.3 mRNA相对表达量分别为58.5±8.4、100.0±11.1，KChIP2 mRNA相对表达量分别为32.3±7.8、100.0±15.9，两组比较，P均<0.05。

3 讨论

心血管疾病一直是威胁中老年人身体健康的主要疾病，发病率随年龄增长而提高，未得到有效治疗往往会因心力衰竭致死。心肌肥大是高血压、心肌缺血等心血管疾病发展过程中的病理特征，临床上表现为心室壁增厚和心肌重量增加。心肌肥厚在开始阶段属于压力容积过载情况下的适应性反应，此阶段心肌能维持正常的输出功能，心肌肥厚的状态可逆转，长时间高负荷会导致心肌细胞内部生理生化因子发生不可逆的变化，造成成纤维细胞的聚集和细胞外基质蛋白的过量沉积，这些将导致心室肌细胞硬化和输缩功能障碍，最终引起心力衰竭而死亡［12-14］。在心肌肥大早期给予药物治疗，可有效改善心肌肥大状态，避免向不可逆的心衰阶段发展，降低患者的病死率。心肌细胞肥大过程涉及到多个细胞内信号转导通路，如分裂原激活蛋白激酶通路、钙调神经磷酸酶通路等，包含内胞内外多种蛋白和信号分子的变化，如血管紧张素、β肾上腺素能受体、G蛋白耦联受体、活性氧（ROS）、胞内Ca2+等［15-18］。β肾上腺素能受体可被血管紧张素激活，是肥大心肌细胞信号转导通路中的上游分子。

心肌肥大的一个重要临床表现是心率失常，严重的心率失常往往会导致猝死，在心肌肥大阶段研究心率不齐的根本原因及分子机制，通过药物改善心率不齐的现象，也是一有效的治疗方法。宏观的心率不齐在单细胞电生理水平表现为细胞动作电位时程的改变，及构成跨膜电位的离子通道电流变化。本文结果表明，观察组心肌细胞动作电位时程比对照组显著延长，肥大心肌细胞在+50 mV电压脉冲刺激下的Ito电流密度较对照组下降。动作电位和Ito的变化是肥大心肌细胞在单细胞电生理水平上呈现的物理特征，还需要研究影响肥大心肌细胞电生理特性变化的分子机制，以阐明改变其电生理特征的内在影响因子，并进一步为临床治疗提供可能的参考靶点。

心肌细胞动作电位的形成取决于不同阶段离子电流的变化。Ito存在于多种哺乳动物心肌组织，其构成成分有Kv4.2、Kv4.3、Kv1.4等［19-20］。Ito的触发时间位于动作电位峰值后的迅速复极阶段，其电流幅度大小直接影响动作电位的时程［21］。构成大鼠心肌细胞Ito的主要离子通道为Kv4.2、Kv4.3及其辅助亚基KChIP2，这些通道基因表达量发生变化或者受胞内生理生化因子的功能调控都将影响Ito的大小［22-24］。本 研 究 表 明，观 察 组Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 mRNA相对表达量较对照组低，这一结果和Ito的变化是一致的。然而mRNA表达水平不能完全反应细胞膜蛋白表达量的变化，要在分子机制上得到确切结论，还需结合Western Blot方法检测3种蛋白的表达量。此外，通道蛋白功能是否受到胞内信号分子调控也有待进一步研究。

总之，大鼠肥大心肌细胞动作电位时程显著延长，Ito显著下降，分子机制可能与Kv4.2、Kv4.3、KChIP2等相关离子通道蛋白表达降低有关。本研究是对心肌肥大发展过程中的病理生理机制和信号转导通路的适当补充，对临床药物研发和药理分析有一定的参考意义。研究仍存在一些不足之处，尽管我们在细胞电生理角度研究了肥大心肌细胞动作电位、Ito等电生理特征的变化，揭示其分子机制为Kv4.3、Kv4.3、KChIP2等相关离子通道表达水平的改变，然而引起Kv4.3、Kv4.3、KChIP2等相关基因表达改变的具体机制仍有待进一步研究，特别是这些离子通道基因调控和已知心肌肥大信号转导通路是否有关联；肾上腺素能受体如何通过G蛋白、PKA磷酸激酶等信号分子作用并调控离子通道基因的表达，其上下游关系如何仍有待阐明。