普鲁士蓝纳米颗粒在生物医学成像及生物医学治疗中的应用研究进展

代岳 ，蔡璐璐 ，卢佳慧 ，沙萱 ，徐凯 ，李菁菁

1 徐州医科大学医学影像学院，江苏徐州221006；2 徐州医科大学附属医院

普鲁士蓝（PB）又称亚铁氰化铁，是一种历史悠久的蓝色染料，Fe3+和Fe2+共同存在赋予了PB 特殊的物理、化学、光学和磁性的优势。早在1936 年，Keggin 和 Miles 就报道了它的结构［1-2］。PB 的特殊分子结构和化学性质，在过去的十几年引起了研究者们极大的兴趣，被广泛应用于电化学、储气、磁学、生物医学、催化、电池、传感器等多个领域，其中在生物医学领域的应用尤为瞩目。2003年，PB被美国食品和药物管理局（FDA）批准作为临床用药［3］。随着纳米科学和纳米技术的不断发展，纳米材料以其制备简单可调控、易于表面功能化和功能化组装、良好的稳定性、较高的载药率、靶向性等多方面的独特优势激发了研究者们的巨大热情，PB 纳米颗粒（PBNPs）同样具有这些独特性质。研究［4］表明，PBNPs 具有较好的顺磁性和近红外光声转换功能，可作为成像对比剂提高病灶检出的灵敏度；PBNPs 具有高效的光热转换性能，在肿瘤光热治疗（PTT）方面被深入研究［5-6］；此外，PBNPs 具有形貌大小可调节、比表面积大，易于表面功能化的优势，能够高效负载化疗药物和成像分子，实现肿瘤药物协同治疗及诊疗一体化研究［7］；更值得一提的是，PBNPs具有类似于Fe3O4纳米颗粒的纳米酶特性。有研究［6，8］表明，PB 纳米酶能够清除体内多余的活性氧（ROS），不仅可以用于治疗ROS 相关疾病，同时能够分解肿瘤区域的H2O2，产生O2用于缓解肿瘤区域缺氧的治疗耐受难题。现将PBNPs 在生物医学成像及生物医学治疗中的应用研究进展综述如下。

1 PBNPs的设计与制备

由于PB的应用范围广泛，传统制备方法多种多样，包括聚合物保护法、模板合成法、水热法、沉淀法等［9-10］。PBNPs 的制备策略主要分为双前体合成法和单前体合成法［3］。双前体合成法主要通过Fe3+/Fe2+和［Fe（CN）6］4−/［Fe（CN）6］3−直接混合得到PBNPs。CHENG 等［4］直接利用FeCl3和K4［Fe（CN）6］制备得到实心PBNPs，该制备方法简单，反应时间较短。单前体合成法利用K3［Fe（CN）6］或K4［Fe（CN）6］在酸性条件下通过缓慢的氧化还原反应释放Fe3+或Fe2+，该制备方法反应时间较长，但制备得到的PBNPs均一性更好。为了使其能够满足不同的生物医学成像、载药、治疗等需求，研究者们对PBNPs 进行了改良制备，从而获得高载药率、靶向输送及诊疗一体化的多功能纳米复合物。中空介孔结构具有较大的表面积和孔容，可作为纳米载体负载药物、基因或成像分子等小分子物质。HU 等［11］研究了一种表面保护、内部刻蚀的方法制备中空介孔普鲁士蓝（HMPB），该方法利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为表面保护剂，盐酸通过PBNPs 表面的缺陷进入内部，在140 ℃条件下刻蚀PBNPs 形成中空介孔结构。反应时间会影响刻蚀的程度，当反应时间为3.5 h 时PBNPs 内部已经开始形成小的腔隙，当反应时间达到4 h时内部的腔隙有所增大，当反应时间达到4.5 h时，纳米颗粒的内部及表面都开始被刻蚀破坏，当反应时间达到5 h 时PBNPs 被完全破坏。因此，可以根据应用的需要控制HMPB内部腔隙的大小。多个研究团队利用该方法制备了HMPB，利用中空介孔结构负载药物实现肿瘤的光热及化疗药的协同治疗，负载超声相变材料构建超声成像对比剂［12-13］。另有部分学者［4，7，14］引入柠檬酸制备实心 PBNPs，并在其表面修饰聚合物分子、红细胞膜及靶向分子等，既可逃避免疫系统对PBNPs 的清除，延长体内循环时间，又提高了靶部位的药物浓度，从而增强治疗效果。近几年，研究者们为了更好地将PBNPs 应用到生物医学领域，构建了基于PB 的核-壳结构的纳米颗粒，例如利用Au 纳米粒或Fe3O4作为核心，以FeCl3和K4［Fe（CN）6］作为前体制备PB 纳米壳，完美实现了集多种功能于一体的诊疗纳米探针的构建［5，15］。

2 PBNPs在生物医学成像中的应用

近年来，医学影像学发展迅速，在疾病诊断和疗效评估方面起着不可替代的作用。医学成像种类繁多，磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、超声（US）成像、荧光成像、光声成像（PA）、正电子发射断层显像（PET）等诊断方式能在无创条件下穿透体表清晰显示体内结构并帮助诊断疾病，而成像对比剂的引入进一步提高了病灶诊断的灵敏度，从而更清晰的在正常组织结构中辨别病灶，有利于疾病的早期诊断和治疗。随着纳米技术的飞速发展，纳米对比剂因其高灵敏度、高特异性、较长体内循环时间和功能多样化等优势被广泛研究。PBNPs具有较好的MRI和PA 特性，同时通过其中空介孔结构和表面可修饰的优势，基于PBNPs结构的荧光成像、US成像、CT 成像也被协同用于疾病的诊断，发挥多模态成像的优势。

2.1 PBNPs 在 MR 成像中的应用 PBNPs 是由 Fe2+和Fe3+形成的混合价态的六氰合铁酸盐，其中和碳原子结合的Fe2+具有较低的自旋（S=0），而和氮原子结合的 Fe3+具有较高的自旋（S=5/2）。2010 年SHOKOUHIMEHR 等［16］研究发现，PBNPs 用于 MRI的纵向弛豫率和横向弛豫率分别是0.079 m/（M‧s）和0.488 m/（M‧s），这一发现开启了PBNPs作为MRI对 比剂 的新篇 章。 2014 年 ，CHENG 等［4］改 进了PBNPs 的制备方法，并在其表面修饰聚乙二醇（PEG），提高其在生理溶液中的稳定性和肿瘤细胞的摄取，通过检测其作为MRI 对比剂的纵向弛豫率和横向弛豫率分别提高到6.4 m/（M‧s）和8.1 m/（M‧s）。由于T1对比剂是阳性对比剂，在临床诊断中更具优势，研究者们对于如何提高PBNPs 的纵向弛豫率进行深入研究。CAI 等［17］以 HMPB-Mn 为基础，搭载化疗药物阿霉素（DOX）构建了pH 响应的HMPB-Mn-DOX 纳米探针用于肿瘤的MR 成像和光热联合化疗。由于肿瘤生长环境偏酸性，研究者在体外进行MRI 纵向弛豫时间的检测发现，与pH=7.4 时相比，当pH=5 时HMPB-Mn 中的Mn2+被大量释放出来，T1弛豫时间明显缩短，HMPB-Mn-DOX 在酸性条件下释放Mn2+的巧妙设计提高了MRI 诊断肿瘤的灵敏度。PERERA 等［18］结合 PBNPs 和 Gd 构建了一种新型的MRI T1 口服对比剂用于消化道的成像，Gd 的引入使得MRI 的纵向弛豫率和横向弛豫率分别达到 16.4 m/（M‧s）和 20.9 m/（M‧s），使 Gd+PBNPs 更适合作为T1 口服对比剂，在家兔胃肠道的体内MRI研究进一步证实了这一观点。SHOU 等［19］利用10%锌离子掺杂制备超小SPBZn 纳米粒，其MRI 对比剂性能和光热转换效率均得到了显著提高，T1 弛豫率高达18.40 m/（M‧s），从而明显提高卵巢癌肿瘤成像的灵敏度和光热治疗效果。

2.2 PBNPs 在 PA 成像中的应用 PA 成像具有无创无辐射成像的特点，它结合了纯光学成像的高对比度特性和纯超声成像的高穿透深度特性，可以提供高分辨率和高对比度的组织成像。2013 年LIANG 等［20］首次证明了 PBNPs 在近红外区域具有很强的吸收能力，可以作为一种很好的光声成像的对比剂。SU 等［21］利用介孔二氧化硅包裹 PBNPs 后负载DOX 构建MCF-7 乳腺癌肿瘤诊疗一体化纳米探针PB+mSiO2-PEG/DOX，体内研究表明，当荷瘤小鼠尾静脉注射纳米探针后，光声信号表现出持续的时间依赖性改变，在注射6 h 后，肿瘤血管的光声信号明显增强，能够清晰的辨别肿瘤边界。CAI 等［22］报道了将Gd3+集成到PB 纳米晶中构建介孔结构HGPB，研究发现在相同浓度下，HGPB在750～970 nm波长处的PA值要高于HMPB，在808 nm时两者均表现出浓度依赖性PA 信号强度，在相同条件下，不同浓度HGPB 的PA 值均高于HMPB，该结果证实了Gd3+掺杂后的 HGPB 比 HMPB 更能显著提高 PA 性能，说明HGPB 可以作为一种优秀的PA 对比剂用于肿瘤的诊断。

2.3 PBNPs 在其他间接成像中的应用 鉴于PB⁃NPs 可以作为过氧化氢酶催化H2O2产生O2，这一功能使PBNPs 在特殊环境中具备超声成像的性能，2012 年 YANG 等［23］利用 PBNPs 这一作用实现了急性肝炎模型的US/MR 的双模态成像，并且该US 成像能够实时监测肝组织内的H2O2水平。此外，基于PBNPs 特殊结构，越来越多的学者尝试将其他成像分子负载或修饰到PBNPs 上，以期获得多模态成像效果，提高成像灵敏度和诊断的准确度。JIA 等［12］在HMPB 介孔内包封相变材料全氟戊烷（PFP），HMPB 具有良好的光热转换效率，能够吸收近红外激光并将其转化为热能，所产生的热量不仅可以通过热疗来杀死肿瘤细胞，还可以促进低沸点的PFP气化产生气泡用于US 成像，该研究表明HPB-PFP具有较高的稳定性和光热转换效率，HMPB-PFP 有望在US成像引导下的肿瘤治疗方面得到广泛应用。除US 对比剂外，有学者以PBNPs 和金纳米粒子（AuNPs）为基础，开发了用于MR/CT 成像和光热/放射增敏治疗的多功能核-卫星结构的纳米粒子CS⁃NPs［15］；另有学者利用 HMPB 的中空介孔结构和可扩展的表面区域负载吲哚菁绿（ICG）和阿霉素（DOX），构建具有荧光成像、光热、光动力和化疗三种治疗方式协同的纳米体系［24］。

3 PBNPs在生物医学治疗中的应用

目前，疾病的传统治疗方法大多存在有创性、非靶向性和治疗方法单一等缺陷，具备独特理化特性的纳米材料为疾病的无创靶向治疗和联合治疗提供了平台。PBNPs因其在光热转换和纳米酶方面的优势和潜力而被广泛研究，主要包括肿瘤及炎性病变的PTT、抗炎、抗氧化治疗等。此外，PBNPs 的中空介孔结构和较大的表面区域能够高效负载化疗药物，修饰特异性靶向分子，实现药物的靶向输送和智能可控释放，有望显著提高疾病的治疗效果。

3.1 PBNPs 在光热治疗（PTT）中的应用 由于Fe3+和Fe2+之间的电荷转移，PBNPs 可以有效地将近红外激光转化为热能来提高温度。FU 等［25］首次研究将PBNPs 作为新一代光热转换剂用于肿瘤细胞的治疗，研究发现，当808 nm激光照射3 min后，PBNPs温度即可升高至43 ℃，表明PBNPs 具有良好的光热转换效率，与Au纳米棒比较时发现在持续照射四个循环后，PBNPs 的光热稳定性明显高于Au 纳米棒。近年来，越来越多的研究者关注PBNPs 的这一性能。JING 等［26］构建了 PB+Au 诊疗一体化纳米探针，由于其良好的光热转换作用，荷瘤裸鼠尾静脉注入纳米探针后，近红外激光照射6 d后HT-29肿瘤变小消失，持续照射 18 d 后肿瘤无复发。SHOU 等［19］通过掺杂10%锌离子构建SPBZn 纳米探针，能够提高近红外光吸收系数和光热转换效率，荷瘤小鼠体内实验表明SPBZn纳米探针对乳腺癌模型治疗效果显著，抑瘤率达到69.4%。PBNPs 的光热转换作用不仅仅局限于肿瘤的光热消融治疗，还能够诱导HMPB 负载的超声相变材料气化，产生气泡用于US成像［12-13］。

3.2 PBNPs 在纳米酶治疗中的应用 纳米酶是一种具有内在酶样特性的纳米材料，纳米酶以其成本低、易制备、稳定性好、易储存等优势有望成为天然酶的替代品。ZHANG 等［8］经系统性的研究发现，PBNPs 具有过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）三种酶活性，能够有效清除多种活性氧成份（ROS）。细胞实验中，用顺铂（CDDP）、二烯丙基三硫（DATS）、紫外光照射、再灌注（HR）、氧化低密度脂蛋白（OxLDL）和高糖（HG）诱导细胞发生氧化应激反应，并用不同浓度的PB⁃NPs 抵抗，发现PBNPs 处理组比PBS 对照组细胞存活率高，并且细胞存活率随着PBNPs 浓度的升高而升高。由于脂多糖（LPS）能够诱导肝脏巨噬细胞产生ROS 和炎性介质，通过给小鼠尾静脉注射LPS 构建急性肝炎模型，而PBNPs 预处理的小鼠尾静脉注入LPS后，与对照组相比肝脏炎症反应模型减轻，该研究利用多种方式、从多个角度证明PBNPs 纳米酶的ROS 清除性能，为PBNPs 用于炎症、动脉粥样硬化、糖尿病等疾病的治疗提供新策略。ZHAO 等［27］构建聚乙烯吡咯烷酮（PVP）修饰的PPB 纳米颗粒，体外实验证明其具有较好的清除OH、H2O2和OOH等ROS 的能力，体内实验通过构建炎症性肠病小鼠模型来观察PPBs的疗效，静脉注入小鼠体内后能够减轻氧化应激反应从而治疗炎症性肠病，研究发现，经静脉注射PPBs的小鼠几乎没有结肠缩短、出血或异常大便的迹象。同时，在组织学分析中，对照组结肠炎小鼠黏膜区域严重破坏，免疫细胞大量浸润，结肠上皮严重受损。相反，PPB 处理的实验组小鼠结肠黏膜区域仅出现轻微损伤，黏膜、肌肉或黏膜下层的免疫细胞浸润较少，这说明PPBs对炎症性肠病小鼠有明显的治疗作用。缺血性脑卒中是一种发病率高、预后差的疾病，缺血性损伤后活性氧和氮（RONS）的过量产生是导致脑损伤加重的关键因素。ZHANG 等［28］利用 PBNPs 的多功能纳米酶作用构建了中空介孔结构HPBZs，不仅能够减轻氧化应激，还能抑制细胞凋亡和炎症反应，从而提高脑组织对缺血性损伤的耐受性。动物实验证明，在缺血/再灌注开始后1 h 给予HPBZs 可显著提高神经系统评分，促进脑葡萄糖代谢，减少脑梗死体积，因此提出基于HPBZs 的纳米平台具有治疗缺血性中风以及其他与RONS 相关疾病的潜力。肿瘤微环境在肿瘤的发生、生长和进展中起着至关重要的作用，ZHANG 等［29］利用低分子量透明质酸修饰 HMPB 构建LMWHA-MPB NPs，发现该纳米颗粒可以作为原位巨噬细胞转化器和O2发生器，体内近红外成像实验显示，IR783 标记的LMWHA-MPB NPs 可以选择性地在肿瘤部位积累，通过HMPB 的过氧化氢酶作用催化分解内源性H2O2产生O2来缓解肿瘤缺氧情况，并且利用LMWHA-MPB 重塑肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型的潜能，抑制4T1肿瘤细胞转移。

3.3 PBNPs 在药物负载及输送中的应用 PBNPs因其独特的中空介孔结构能够负载化疗药物，不仅明显提高载药率，同时表面修饰靶向分子后可实现药物的靶向输送，用相对较小浓度的药物即可达到相同的治疗效果，并且降低传统药物的全身不良反应［15，30］。有研究利用肿瘤偏酸性的微环境和HMPB的光热转换作用构建智能纳米载药平台，实现药物的可控释放，结果显示协同治疗效果明显提高［14，31］。一氧化碳（CO）能够引起线粒体功能障碍，诱导癌细胞凋亡，是一种很有前途的新兴治疗方法，LI 等［32-33］分别利用HMPB 和Fe（CO）5制备了PB-CO NPs，利用近红外激光触发CO 的释放，加重癌细胞的缺氧环境，促进癌细胞凋亡，研究结果表明，PB-CO NPs 的CO和光热协同治疗对肿瘤的治疗效果显著。

3.4 PBNPs在智能化、多功能化及诊疗一体化中的应用 随着人们对PBNPs 研究的深入，一系列独特性能的发现使其在生物医学领域的应用日益增多，通过巧妙地设计以及引入靶向分子、成像分子或治疗药物，研究者们构建了多种智能化、多功能化及诊疗一体化的纳米探针，应用在生物医学诊疗中。ZHOU 等［13］研究设计了一种肿瘤靶向氧化还原反应的复合生物催化剂，该催化剂可将肿瘤饥饿治疗与低温光热治疗结合，HMPB 介孔内负载葡萄糖氧化酶，表面修饰透明质酸靶向肿瘤细胞，由于HMPB纳米酶作用催化H2O2产生O2，同时结合葡萄糖氧化酶的作用增加葡萄糖消耗，并且抑制热休克蛋白的表达促进低温光热疗法。YIN 等［34］研究了一种基于HMPB 的近红外光触发一氧化碳（CO）释放系统，该系统可使具有生物还原活性的抗癌药物替拉帕扎胺（TPZ）选择性地被缺氧反应激活。Fe（CO）5通过配位作用与HMPB 偶联，TPZ 被包裹在HMPB 的孔隙中，并以PEG 修饰来延长血液循环，改善肿瘤蓄积。在肿瘤部位近红外激光照射下，HMPB 的非致死光热效应释放CO，加速线粒体耗氧量，加重缺氧，激活TPZ 导致癌细胞凋亡，从而实现协同抗癌作用。ZHANG 等［35］研究了一种基于 HMPB 的智能和多功能纳米平台，其中空介孔结构包封DOX 和全氟乙烷（PFH），体外和体内研究证实，HMPB-DOX/PFH 可作为双模态成像对比剂，同时增强US 和PA 成像效果，可用于指导和监测肿瘤治疗。在高强度聚焦超声（HIFU）作用下，这种多功能的HMPBs-DOX/PFH能够以较低的HIFU 强度实现凝固性坏死，同时促进DOX 的释放，提高了化疗疗效，该纳米平台实现了双模态成像引导下的非侵入性协同肿瘤治疗。

综上所述，随着PBNPs 一系列特殊性能的发现，PBNPs 被认为是一种非常有前途的生物医学纳米材料。前期PBNPs 的MRI、PA 成像及光热治疗、载药协同治疗等主要被用于肿瘤模型，近几年PB⁃NPs 纳米酶活性的发现更加拓宽了其在医学领域中的应用，不仅被用于调节肿瘤微环境中氧的水平促进肿瘤治疗，同时有望用于多种炎症性疾病的抗炎、抗氧化治疗。然而，所有这些研究仍处于实验室阶段，PBNPs 在体内的药理作用、毒理作用、药代动力学特征和生物安全性评价有待进一步深入研究，这将有效促进PBNPs 作为成像对比剂及治疗药物的临床转化。