沉默Pard3 基因对宫颈癌细胞系SiHa 迁移、侵袭的影响及其机制

刘迎嘉，阿仙姑·哈斯木

1 新疆医科大学第五附属医院，新疆乌鲁木齐830011；2 新疆医科大学

研究［1］显示，宫颈癌晚期复发患者预后差，与肿瘤细胞的侵袭和转移关系密切。分离缺陷基因3（Pard3）的产物是一种分布在正常细胞的极性蛋白，它的改变和缺失都会造成肿瘤细胞的侵袭、转移［2］。研究［3］发现，JAKs/STAT3 信号转导通路的激活具有调节免疫系统、促进细胞生长和细胞周期、抗凋亡等作用，并与肿瘤的发生发展密切相关。目前关于Pard3 和JAK2/STAT3 在宫颈癌侵袭转移中的作用机制尚不清楚。2017 年 6 月 1 日—2020 年 6 月 30日，本研究观察了沉默Pard3 基因对宫颈癌细胞系SiHa迁移、侵袭的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞分组及Pard3 小干扰RNA 转染 将人宫颈癌细胞系SiHa 细胞培养于10% 胎牛血清的DMEM 中，37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，当细胞密度达到80%时用PBS 清洗、0.25%的胰蛋白酶消化后，加入完全培养基，按 1∶3 的比例传代，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下扩大培养。针对Pard3 转录本（GAAGGTCTATGTCTACTGA 和GAAACAGCGTT⁃GGATGATA）设计小干扰RNA（siRNA）1 和siRNA2序 列 ，分 别 为 GGATAACAGTCGTGTTGAA、GAAGGTCTATGTCTACTGA，并构建Pard3基因沉默腺病毒表达载体。将SiHa 细胞分为siRNA1 组、siR⁃NA2 组、siRNC 组，siRNA1 组转染 siRNA1，siRNA2组转染siRNA2，siRNC 组转染空白载体，转染后在37 ℃、5%CO2培养箱中继续孵育48 h。

1.2 三组细胞迁移和侵袭能力观察 采用Tran⁃swell 迁移和侵袭试验。①Transwell 迁移实验：取处理好的SiHa 细胞PBS 清洗，0.25%胰酶消化收集，1 000 r/min 离心 5 min，去上清，PBS 润洗两次，清洗掉残余血清，加入无血清DMEM 培养基稀释细胞浓度至2.5×105/mL，备用。DMEM 培养基中加入Tran⁃swell 小室，分别接入 200 μL 各组细胞悬液，37 ℃5%CO2培养箱中培养。取出Transwell 小室，PBS 清洗，70%冰乙醇溶液固定细胞1 h，用干净的棉球将上室一侧的未迁移细胞擦干净，200 倍显微镜下观察拍照，计算细胞迁移相对数量。各组细胞迁移相对数量=各组迁移细胞数/siRNC 组迁移细胞数×100%。②侵袭实验：取处理好的SiHa 细胞PBS 清洗，0.25%胰酶消化收集，1000 r/min 离心5 min，去上清，PBS 润洗两次，清洗掉残余血清，加入无血清DMEM 培养基稀释细胞浓度至2.5×105/mL，备用。DMEM 培养基中加入Transwell 小室后，于上室底部中央垂直加入100 μL终浓度为1 mg/mL的Matrigel，待Matrigel 干成胶状后在Transwell 上室分别接入200 μL 各组细胞悬液，37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。取出Transwell小室，PBS清洗，70%冰乙醇溶液固定细胞1 h，用干净的棉球将上室一侧的未侵袭细胞擦干净，200 倍显微镜下观察拍照，计算细胞侵袭相对数量。各组细胞侵袭相对数量=各组侵袭细胞数/siRNC组侵袭细胞数×100%。

1.3 三组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 检测 采用实时定量PCR（qRTPCR）法。取各组细胞，使用TRIzol 试剂提取总RNA，Prime-Script 反转录成 cDNA。以 cDNA 为模板，以GAPDH 为内参基因，进行PCR 反应。引物序列如下：Pard3 上游引物为 5′-CAGGTGCATCGCTT⁃GGAAC-3′，下游引物为 5′-GCTGAGACATTGTTG⁃GTGCC-3′；JAK2 上 游 引 物 为 5′-GTCATG⁃GCCCAATTTCGATGG-3′，下游引物为5′-TCGCTC⁃GACAGCAAAAGTCA-3′；STAT3 上 游 引 物 为 5′-AGAAAACATGGCTGGCAAGG-3′，下游引物为 5′-GCCTCCTTCTTTGCTGCTTT-3′；E-cadherin 上游引物为 5′-CGTAGCAGTGACGAATGTGG-3′，下游引物为 5′-CTGGGCAGTGTAGGATGTGA-3′；Vimentin上游引物为5′-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3′，下游引物为5′-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-3′。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 个 循 环 。 以 2-ΔΔCt表 示 细 胞 中 目 的mRNA的相对表达量

1.4 三组细胞中Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白检测 采用 West⁃ern blotting 法。取各组细胞，用Cell Mitochondria Isolation Kit 试剂盒分离线粒体和细胞浆蛋白，使用DG-3022A 酶标仪测定OD568值，根据标准蛋白浓度和相应的OD 值计算直线回归方程得出样品蛋白浓度。将提取的蛋白上清沸水浴变性后和MARKER加入上样孔进行电泳分离，取出凝胶根据MARKER切下目的条带转膜。用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭液浸泡PVDF 膜进行封闭，4 ℃条件下过夜，加入兔单克隆抗体，用PBS-Tween 20洗涤印迹3次，洗涤后HRP 二抗显影、冲洗胶片，用BandScan 分析胶片灰度值，以灰度值表示目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 5 统计软件。计量资料以-x ± s表示，比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组细胞迁移和侵袭能力比较 ①siRNA1组、siRNA2 组、siRNC 组细胞迁移相对数量分别为122.3±4.3、129.2±7.1、100.0±7.1，其中siRNA1组、siRNA2 组迁移相对数量与 siRNC 组相比，P均＜0.05。②siRNA1 组、siRNA2 组、siRNC 组细胞侵袭相对数量分别为120.5 ± 5.8、131.3 ± 7.9、100.0 ±9.0，其中 siRNA1 组、siRNA2 组侵袭相对数量与siRNC组相比，P均＜0.05。

2.2 三组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 相对表达量比较 siRNA1 组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA相对表达量分别为0.7±0.2、1.2±0.3、1.1±0.1、0.7 ± 0.1、1.9 ± 0.3，siRNA2 组分别为 0.4 ± 0.1、1.0± 0.3、1.1± 0.2、0.5± 0.1、2.4± 0.3，siRNC组分别为 1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1，其中 siRNA1 组、siRNA2 组 Pard3、E-cad⁃herin、Vimentin mRNA 相对表达量与 siRNC 组相比，P均＜0.05。

2.3 三组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量比较siRNA1 组中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vi⁃mentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量分别为70.8 ± 1.5、101.9 ± 1.4、103.4 ± 7.0、74.6 ± 1.2、152.6 ± 7.4、174.7 ± 11.7、169.0 ± 6.0，siRNA2 组分别为49.6±1.0、102.1±0.9、100.0±6.3、62.6±2.1、182.9 ± 4.4、220.4 ± 5.8、191.7 ± 9.7，siRNC组分别为 100.0 ± 3.6、100.0 ± 3.3、100.0 ± 2.7、100.0 ± 3.1、100.0 ± 1.4、100.0 ± 5.5、100.0 ±3.2，其中 siRNA1 组、siRNA2 组 Pard3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋 白 相 对 表 达 量 与siRNC组相比，P均＜0.05。

3 讨论

肿瘤进展的第一步是肿瘤细胞脱离环境获得运动性和侵袭性，与上皮-间质转化（EMT）的特征相对应［4］。在EMT 进程中，上皮细胞失去细胞间连接和顶端极性，获得间质和迁移特性，发生细胞形态和遗传标记的改变，包括上皮标记（如E-cadherin）的消失和获得间充质标记（如a-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白）［5-6］。研究［7］显示，细胞间相互连接作用减弱、失去细胞间黏连并改变细胞极性，往往是导致肿瘤细胞侵袭迁移的关键原因，而上皮细胞极性主要是依靠极性蛋白来调控的。

正常上皮细胞沿内部尖端基底轴呈现蛋白质的不对称分布，呈现极性状态，这种极性状态是由极性蛋白介导的。目前已知的极性蛋白有PAR 家族，包括 aPKC、Pard3 和Pard6 构成的极性复合物。研究［8］发现，在食管癌、乳腺癌、肺癌等细胞中，极性和上皮组织的丧失与恶性肿瘤和肿瘤进展密切相关。通过对siRNAPard3 食管鳞状细胞癌109 细胞系的研究［8］发现，Pard3 过表达降低了109 细胞的基础增殖率，抑制了DNA 复制，抑制了肿瘤细胞增殖和细胞凋亡，而沉默Pard3 则促进肿瘤细胞增殖和凋亡；与对照组相比，Pard3 过表达显著降低约50%的细胞侵袭能力，而沉默Pard3则显著促进109细胞的侵袭能力。乳腺癌细胞株MDA-MB-231 和SK-BR3 中过表达GAB1 增强了与Pard3 的相互作用，导致了Pard3与非典型PKC 极性蛋白复合物的解离，促进了乳腺癌细胞的侵袭、迁移。有报道在人肺腺癌组织中Pard6b 和PKC 的表达低于癌旁正常肺组织，实验小鼠腺癌组织中Pard3 和PKC 水平亦降低；此外发现Pard3 基因体中的甲基化位点与Pard3 的表达呈正相关，Pard3基因的甲基化增加了细胞对卡铂的敏感性，对Pard3的抑制增加了肺癌细胞的化疗耐药性。

本研究利用沉默Pard3 基因载体转染SiHa 细胞，与对照组siRNC相比，实验组siRNA1、siRNA2转染48 h 后Pard3mRNA 和蛋白相对表达量呈明显现下降趋势，其中siRNA2 组下降更为显著，说明基于Pard3 转录本的两条小干扰RNA 序列设计成功，同时Pard3基因沉默腺病毒载体转染SiHa 细胞的基因转染实验亦成功。体外siRNA 成功沉默Pard3 基因后，通过对Transwell 小室的基底膜进行侵袭、迁移后附着的细胞数量明显增加，说明沉默Pard3 后Si⁃Ha 细胞迁移、侵袭能力增强。ZHANG 等［9］研究发现，抑制miR-483可增加Pard3的表达，抑制miR-483可降低TGF-271 诱导的细胞迁移和侵袭能力，Pard3的下调导致了间变性甲状腺癌细胞的侵袭，提示Pard3 过表达可减弱肿瘤细胞侵袭、迁移能力，而Pard3低表达或沉默则增强细胞侵袭、迁移。

JAKs/STAT3 是恶性肿瘤增殖、进展和凋亡的经典途径。LI 等［10］通过建立 3p22.2 抑癌基因与STAT3形成蛋白复合物，阻断STAT3与JAK2相互作用和 STAT3 磷酸化，IL-6 的刺激增强了 DLEC1 与STAT3 的结合，使STAT3 与JAK2 的相互作用减弱，进而导致STAT3 磷酸化水平降低，最终导致淋巴结转移、肿瘤复发和转移。WANG 等［11］体外研究发现，抑制LINC00518 表达可显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。LINC00518的下调抑制了JAK/STAT3 的激活，进而降低了N-cad⁃herin 和 Vimentin 的表达。研究［12］发现，多种肿瘤中不同抑癌基因可以通过调控JAK/STAT3 通路的活性来抑制肿瘤的发生。有学者［13］首次报道宫颈鳞癌细胞中过表达抑癌蛋白M 受体（OSMR）、抑癌蛋白（OSM）及STAT3持续激活而调控细胞自主前馈信号通路。与抑癌蛋白M 受体过表达相关的恶变前效应主要是由JAK-STAT3 激活介导的，此通路受外源性OSM 和自分泌OSM-OSMR 相互作用所调控。通过中和抗体特异性抑制OSM-OSMR 相互作用，显著抑制STAT3 激活和前馈信号，导致侵袭、血管生成和迁移减少，提示STAT3被激活、STAT3信号通路被抑制可能是宫颈癌干预治疗的有效靶点。本研究发现，与转染后的siRNC组相比，siRNA1组、siRNA2组的JAK2、STAT3 的mRNA 和蛋白的相对表达量均无显著差异，而磷酸化的JAK2 和STAT3 蛋白表达增加，siRNA2 组升高显著，说明沉默Pard3 基因上调JAK2/STAT3 磷酸化信号转导通路，发挥生物调节功能，促进了肿瘤细胞的侵袭、迁移。

E-cadherin 是一种分布在细胞表面和细胞间连接处的细胞黏附分子，表达缺失可导致细胞连接的破坏，肿瘤组织中E-cadherin 表达缺失提示肿瘤细胞浸润转移的可能性较高。Vimentin 主要分布在间叶组织中，因此，E-cadherin 和Vimentin 常被作为肿瘤细胞发生上皮间质转化即EMT 的遗传标记。LI等［14］在体外肝细胞性肝癌细胞系中通过靶向E-cad⁃herin、N-cadherin、Vimentin 和 Twist 相 关 蛋 白 1（Twist），探讨了肿瘤抑制因子UPF1 表达水平对EMT 过程的影响，结果显示，UPF1 过表达时，N-cad⁃herin、Vimentin 和 Twist 表达水平明显上调，E-cad⁃herin 表达下调，蛋白阵列分析则报道了相反的结果。ZHOU 等［15］用免疫组化染色检测 10 例良性和42 例口腔鳞癌肿瘤组织E-cadherin 和Vimentin 的表达，E-cadherin 在正常口腔黏膜上皮中阳性表达，而波形蛋白在正常口腔黏膜上皮中未见表达；42 人中有26 人（61.9%）和16 人（38.1%）表达E-cadherin 和Vimentin，E-cadherin、Vimentin 表达与淋巴结转移、肿瘤分期有显著相关性。本研究发现，siRNA1组和siRNA2组中E-cadherin mRNA 和蛋白相对表达量显著降低，siRNA2组降低更显著；siRNA1组和siRNA2组VimentinmRNA 和蛋白相对表达量均显著升高，其中siRNA2 组显著升高，提示Pard3 沉默后，SiHa细胞的上皮特征减弱、间质特征增强，导致明显的上皮间质转化加速EMT进程。

综上所述，沉默Pard3 通过上调JAK2/STAT3 信号通路磷酸化，促进SiHa 细胞迁移和侵袭并发生明显的EMT，从而促进肿瘤进展。