miR-146a 对LPS/Aβ1-42诱导的人小胶质细胞系HMC3炎症反应及细胞凋亡调节作用观察

邹婷 ，范炜豪 ，张妙萍 ，陈燕婷 ，崔理立 ，3，梁春梅 ，3

1 广东医科大学/广东省衰老相关心脑疾病重点实验室，广东湛江524000；2 粤北人民医院；3 广东医科大学附属医院

在神经炎性疾病中，小胶质细胞起着至关重要的作用。生理状态下，小胶质细胞处于静止状态。当大脑出现炎症反应时，小胶质细胞被激活成活化状态，其细胞体积变大、胞体变圆、细胞表面的突起消失，形态由静止的分枝状变成活化的阿米巴状［1-2］。小胶质细胞被激活后以两种极化形式（M1/M2）存在，一方面，小胶质细胞作为大脑的常驻细胞，参与了组织发育、结构完善、神经稳态环境的维持、对损伤的反应以及随后的重塑及修复，可清除病原体、死亡的细胞、碎片或异常蛋白，从而对病原体产生免疫反应，监测组织变化并维持组织稳态；另一方面，小胶质细胞在慢性炎症也对中枢神经组织有一定的损害作用。当中枢神经系统损伤时，小胶质细胞激活后产生的自由基、超氧化物阴离子、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等多种物质可加重损伤，影响神经细胞的凋亡［3-4］。microRNA-146a（miR-146a）是一种先天免疫应答调节剂，在炎症和先天免疫系统的调节中起重要作用。研究［5-6］显示，通过NF-κB 信号通路进行的促炎信号转导可导致miR-146a 表达增加，而miR-146a 可通过抑制NF-κB 信号通路上游的白细胞介素1 受体相关激酶-1（IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）而发挥负反馈作用，从而抑制NF-κB 转录活性，进一步抑制了 NF-κB 靶点的表达基因，如IL-6、IL-1β 和TNF-α。总的来说，在炎症刺激下miR-146a 被上调，其又负反馈抑制炎症发展。此外，研究［7］表明，miR-146a不仅参与先天免疫的调节，而且还影响其他生物学功能，例如细胞凋亡、迁移、增殖，表明其在生理和疾病过程中具有广泛的功能。miR-146a 在许多与炎症相关的疾病和病理过程中，特别是在神经系统中被调节，表明其在神经系统疾病及神经炎症方面具有重要作用。2018 年12月28日—2020年6月20日，本研究观察了转染miR-146a对脂多糖（LPS）或β-淀粉样多肽1-42（Aβ1-42）诱导的人小胶质细胞系HMC3炎症反应及凋亡的调节作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人小胶质细胞系HMC3购自上海中乔新舟生物公司，LPS 购自北京solarbio 公司，Aβ1-42购自上海强耀生物科技有限公司，胎牛血清购自美国Gibco 公司，胰酶购自美国Gibco 公司，DMEM/F-12 培养基购自美国HyClone 公司，双抗（青霉素、链霉素）购自美国Gibco 公司，Lipo⁃fectamine 3000 Reagent 购自美国 Thermo 公司，miR-146a 激动剂模拟物（miR-146a mimics）及阴性对照错义链（mimics NC）购自广州锐博公司，反转录试剂盒Real-time PCR 试剂盒购自日本TAKARA 公司，Annxein V-PE/7AAD 凋亡试剂盒购自翊圣公司，ELISA 试剂盒购自武汉BOSTER 公司，荧光定量PCR 仪（LightCycler480）购自美国罗氏生物，低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，酶标仪购自美国Thermo 公司，BD FACSCantoⅡ流式仪购自美国BD公司。

1.2 细胞分组及miR-146a 转染 HMC3 细胞使用含10%胎牛血清、1%的双抗加入到DMEM/F12 完全培养基在37 ℃、5%CO2细胞培养箱传代培养。每天在倒置显微镜下观察细胞，每隔2～3 d传代1次，用含EDTA 胰酶消化2 min 后加两倍体积培养基终止胰酶消化，传代3 次后进行实验。将HMC3 细胞分为LPS诱导组和Aβ1-42诱导组，各组下设3个小组。将 LPS 诱导组分为 A、B、C 组。A 组转染 10 nmol/L的mimicis NC；B 组转染10 nmol/L 的mimicis NC，继续培养 24 h 后，加入 100 ng/mL 的 LPS 诱导 72 h；C组转染10 nmol/L 的miR-146a mimicis，继续培养24 h 后，加入 100 ng/mL 的 LPS 诱导 72 h。将 Aβ1-42诱导组分为 a、b、c 组。a 组转染 10 nmol/L 的 mimi⁃cis NC；b 组转染 10 nmol/L 的 mimicis NC，继续培养24 h 后，加入 5 μmol/L 的 Aβ1-42诱导 12 h；c 组转染10 nmol/L 的 miR-146a mimicis，继续培养 24 h 后，加入5 μmol/L的Aβ1-42诱导12 h。

1.3 各组细胞中炎症因子IL-6 检测 采用ELISA法。取各组细胞，4 ℃条件下5 000 r/min离心15 min，取上清液按照ELISA 试剂盒操作说明书检测各组IL-6的表达水平。

1.4 各组细胞凋亡率测算 取各组细胞，用不含EDTA 的 0.25%胰酶37 ℃消化2 min 后，4 ℃条件下1 000 r/min离心弃上清，用PBS重悬，轻洗两遍后用250 μL binding buffer重悬细胞，转移至流式管，加入Annxein V-PE/7-AAD 凋亡试剂，室温避光孵育15 min，加入400 μL 的binding buffer，用流式细胞仪检测凋亡率。

1.5 统计学方法 采用GraphPad prism 7.0统计软件。计量资料以表示，组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中炎症因子IL-6 表达水平比较 A、B、C 组细胞中炎症因子IL-6 表达水平分别为（1.73± 0.04）、（15.80 ± 0.58）、（10.73 ± 0.43）ng/mL，其中 B 组与 A、C 组相比，P均＜0.05。a、b、c 组细胞中炎性因子 IL-6 表达水平分别为（2.85 ± 0.14）、（4.32 ± 0.39）、（3.01 ± 0.25）ng/mL，其中b 组与a、c组相比，P均＜0.05。

2.2 各组细胞凋亡率比较 A、B、C 组细胞凋亡率分别为7.90% ± 0.80%、13.00% ± 0.64%、9.47% ±0.35%，其中B 组与A、C 组相比，P均＜0.05。a、b、c组细胞凋亡率分别为2.00% ± 0.60%、5.70% ±0.49%、2.60% ± 0.70%，其中 b 组与 a、c 组相比，P均＜0.05。

3 讨论

研究［4，8］表明，许多中枢神经系统疾病的病理过程中均有炎症反应的参与。小胶质细胞介导的神经炎症是包括帕金森氏病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症在内的各种神经退行性疾病的最显著特征之一。小胶质细胞介导的神经炎症和细胞凋亡参与许多神经退行性疾病，比如阿尔茨海默病、帕金森病等［9］。在病理状态下，活化的小胶质细胞释放与疾病有关的炎症介质，从而促进神经炎症，并进一步促进神经细胞凋亡［10］。小胶质细胞在静息状态下，其清除脑内坏死或凋亡的神经元，吞噬潜在的有害物质及细胞碎屑，参与突触的重塑，起到维持中枢神经系统正常组织稳态的作用［11］。中枢神经系统小胶质细胞的激活是异质性的，可分为两种截然相反的类型：M1表型和M2表型。根据被激活的表型，小胶质细胞可以产生细胞毒性或神经保护作用［12］。M1 型小胶质细胞激活后产生 TNF-α、IL-1β、IL-6 等多炎症因子，导致神经元变性、坏死，对神经系统有损害的作用。M2型小胶质细胞激活后发挥吞噬作用，分泌大量抗炎因子、营养因子、细胞外基质成分以及神经元递质样分子，从而发挥保护神经的作用［13-14］。综上所述，小胶质细胞在神经系统炎性疾病中起着至关重要的作用。小胶质细胞介导的炎症和细胞凋亡被认为是神经退行性疾病发生或恶化的可能机制［15］。小胶质细胞的长时间激活会导致活性氧（ROS）和促炎细胞因子等有害分子的过度产生，从而导致有害的细胞效应，并常常导致神经细胞死亡。LPS是经典的炎症模型诱导物。研究［9］表明，在神经退行性病变周围，通常能发现被活化的小胶质细胞。持续活化的小胶质细胞可释放IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎症细胞因子，加速多种神经退行性疾病的疾病进展。用LPS 诱导小胶质细胞的急性炎症后，小胶质细胞会触发急性炎症反应，分泌大量炎症因子［16］。然而在 HMC3 细胞中，相关研究［17］报道，HMC3 细胞分泌的 TNF-α、IL-1β 较低，不足以被炎症刺激，但可引起IL-6 的升高。有研究［18］表明，LPS能够刺激小胶质细胞激活，但是并不能有效准确模拟阿尔茨海默病和观察小胶质细胞的激活，而化学合成的Aβ1-42寡聚体对细胞具有毒性作用并能刺激小胶质细胞产生炎症反应。因此，我们也用Aβ1-42构建小胶质细胞的慢性炎症模型。所以，在本研究中，我们观察了在LPS 或Aβ1-42刺激下小胶质细胞的炎症反应和凋亡率。

miR-146a 是众所周知的与炎症相关的microR⁃NA，miR-146a的相关单核苷酸多态性与多种炎症性疾病有关［19］。研究［19］表明，miR-146a 基因多态性与神经系统疾病的风险相关，且miR-146a 表达水平的改变在许多神经系统疾病的发病机制中是至关重要。miR-146a 的靶基因还参与调节神经系统疾病的病理生理过程，特别是神经炎性反应［20-22］。综上所述，miR-146a 在神经系统疾病发展过程中的神经炎症中起重要作用，可能会成为一个有前景的生物标志物和治疗靶点。在前期的实验中，我们验证了100 ng/mL 的 LPS 刺激 HMC3 72 h 后炎症因子 IL-6表达水平较高，5 μmol/L 的Aβ1-42刺激HMC3 72 h 后炎症因子IL-6 表达水平较高，所以后续选用为此浓度和时间点。本研究结果显示，在100 ng/mL的LPS或5 μmol/L 的Aβ1-42刺激下，HMC3 细胞的炎症因子IL-6 的表达水平上升，而转染miR-146a mimics 后可抑制小胶质细胞的炎症因子IL-6 的分泌，从而降低炎症反应。进一步探究其凋亡水平，在100 ng/mL的 LPS 或 5 μmol/L 的 Aβ1-42刺激下，HMC3 细胞凋亡率升高，而转染 miR-146a mimics 后，HMC3 细胞凋亡率得到抑制。实验结果表明，miR-146a 可抑制LPS和Aβ1-42诱导下HMC3细胞中炎性因子IL-6的分泌，还可进一步抑制凋亡，但其具体机制还需进一步探索。

综上所述，转染miR-146a对LPS或Aβ1-42诱导的HMC3 炎症反应具有抑制作用，并可降低其凋亡率。因此，我们认为miR-146a 有望成为改善神经炎性疾病及神经退行性病变的治疗靶点，但miR-146a 对神经炎症的作用机制有待在动物体内进一步研究。